German Title: Neue biologische Werkzeuge für die genetische Manipulation des Mausgehirns

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Abstract

The site-specific gene expression in the mouse brain is the most crucial issue for genetic studies of brain networks. In our studies, we used different fluorescent proteins (FPs) for monitoring brain anatomy, while for the functional analysis, proteins such as Cre recombinase and the tetracycline-controlled transactivator (tTA) were investigated. From the technical point of view, we attempted both mouse transgenic technology and recombinant adeno-associated virus (rAAV) gene delivery in vivo for transferring functional proteins into specific cell types of the mouse brain. First we analyzed the cell-type specificity of a bacterial artificial chromosome (BAC) transgene. We selected an enhanced green fluorescent protein (EGFP) recombined BAC (from Genesat project) which was supposed to have mitral/tufted cell specific expression in the olfactory bulb. By pronuclear injection of the BAC, different founders were obtained. Out of 41 potential founders, one was mitral cell specific, and two were specific for mitral and tufted cells. Regarding the limitations of cost and time using the mouse transgenic technology, we switched as an alternative approach to the rAAV gene delivery system. For visualizing cells that express the virus-delivered proteins, we applied two strategies: one with tTA/rtTA and its bi-directional responder Ptetbi to express Cre recombinase together with an FP in the specific brain regions. This provided a strong expression level of both Cre and FPs in cultured neurons and in neurons in the brain. For the second strategy, we applied a slightly modified T2A self-cleaving peptide bridge for the quantitative expression of Cre recombinase or tTA/rtTA together with FPs, respectively. By applying the T2A peptide approach, two proteins can be almost equally expressed with one rAAV construct. This opens a new avenue for gene function analysis in the central nervous system. Next we analyzed whether rAAV can be used for the cell-type-specific expression. We selected glia cells, since in the transgenic field, specific promoters are described for proteolipidprotein (PLP) and glial fibrillary acidic protein (GFAP). As second cell population we analyzed promoters for local interneurons, the glutamate decarboxylase 67 (GAD67) and the cholecystokinin (CCK). We investigated a complementation approach which splits Cre recombinase into two parts (N-Cre and C-Cre), each driven by a different promoter. The Cre recombinase is active when N-Cre and C-Cre are expressed in the same cell. With this genetic complementation approach, the infected Cre positive cells could be defined as PLP and GFAP or GAD67 and CCK double positive cells, respectively. Thus, the cell-type-specific expression is achieved via rAAV delivery, and the double positive cells for two different promoters are illustrated with the Cre complementation approach. BAC transgenic technology, rAAV gene in vivo delivery, tTA/rtTA inducible gene activation, 2A peptide cleavage approach and the Cre complementation system, all these newly developed biological tools can be taken advantage of different aspects for different experimental purposes. Moreover, they open a convenient avenue for site-specific and cell-type-specific gene expression in manipulating brain circuits.

Translation of abstract (German)

Eine lokal kontrollierte Genexpression bei Mäusen ist einer der wichtigsten Forschungsansätze in genetischen Studien zur Gehirnfunktion. In unseren Studien analysierten wir verschiedene fluoreszierende Proteine (FPs), die Cre Rekombinase und den durch Tetrazyklin regulierten Transaktivator (tTA), die mittels transgener Maustechnologie oder rekombinantem Adeno-assoziierten Viren (rAAV) System in das Mausgehirn eingebracht wurden. Zunächst wurde die zelltypische Besonderheit eines Transgens analysiert, das verstärkte grün fluoreszierenes Protein (EGFP), das spezifisch im Mausgenom in Mitral-/Tuftzellen des Bulbus olfactorius exprimieren sollte. Durch pronukleare Injektion des baterial artificial Chromosomes (BAC) wurden verschiedene Gründertiere erzeugt. Von 41 potentiellen Gründern zeigte einer eine spezifische Expression in Mitralzellen und zwei in Mitralzellen und Tuftzellen. Zwecks einer Reduzierung von Kosten und Zeit, die bei der transgenen Maustechnologie anfallen, veränderten wir unsere Vorgehensweise und verwendeten das rAAV Gentransfer System. Um Zellen, welche die viral übertragenen Proteine exprimieren, zu visualisieren, wurden zwei Strategien angewendet: Zum einen wurden tTA/rtTA mit ihrem bi-direktionalen Responder Ptetbi übertragen, so dass Cre Rekombinase zusammen mit einem FP in der spezifischen Gehirnregion exprimiert wird. Dadurch wurde ein sehr vielversprechendes Expressionslevel von Cre und FPs in kultivierten Neuronen und in den injizierten Regionen erreicht. Für die zweite Strategie wurde eine leicht modifizierte T2A selbstschneidende Peptidbrücke verwendet, um die quantitative Expression der Cre Rekombinase oder auch von tTA/rtTA zusammen mit den FPs zu erreichen. Durch die Anwedung des T2A Peptid Ansatzes können zwei Proteine annähernd equimolar durch einen rAAV Genetransfer Vektor exprimiert werden. Dies eröffnet neue Möglichkeiten der Genfunktionsanalyse im zentralen Nervensystem. In einem nächsten Schritt untersuchten wir, ob rAAVs für eine zelltypspezifische Expression angewendet werden können. Wir wählten Gliazellen, da in der transgenen Technologie spezifische Promotoren für das Proteolipidprotein (PLP) und das saure Gliafaserprotein (GFAP) beschrieben sind. Als zweite Zellpopulation analysierten wir die Promotoren für lokale Interneuronen, Glutamat Decarboxylase 67 (GAD67) und Cholecystokinin (CCK). Wir untersuchten einen Komplementierungsansatz, welcher die Cre Rekombinase in zwei Teile (N-Cre and C-Cre) auftrennt, wobei dieser Vorgang unter der Kontrolle von zwei verschiedenen Promotoren abläuft. Durch die Verwendung dieses Ansatzes wurde gezeigt, dass die Cre Rekombinase nur exprimiert wird, wenn beide Promotoren zur selben Zeit in der selben Zelle aktiv sind. Mit dem genetischen Komplementierungsansatz können die infizierten Cre positiven Zellen als PLP und GFAP oder GAD67 und CCK doppelt positive Zellen definiert werden. So wird die Zelltyp spezifische Expression durch rAAV Übertragung erreicht und die doppelt positiven Zellen für zwei verschiedene Promotoren durch den Cre Komplementierungsansatz dargestellt. Mit all diesen neu entwickelten biologischen Werkzeugen, transgene BAC Technologie, in vivo rAAV Genübertragung, tTA/rtTA induzierbare Genaktivierung, der 2A Peptid Ansatz und das Cre Komplementierungssystem, kann ein Vorteil für verschiedene Aspekte und experimentelle Zwecke erzielt werden. Darüber hinaus eröffnen sie eine gute Möglichkeit der ortsspezifischen und zelltypspezifischen Genexpression, indem sie die Gehirnschaltkreise manipulieren.