English Title: Characterization of the guanine nucleotide exchange factor GBF1

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Abstract

Im initiierenden Schritt der COPI-Vesikelbiogenese wird die kleine GTPase Arf1 von den beiden zur p24 Proteinfamilie gehörenden Typ I-Trans-membranproteinen p23 bzw. p24 an die Membran rekrutiert. Dort vermittelt GBF1 (Golgi-specific brefeldin A-resistance factor 1), ein sogenanntes Arf GEF (guanine nucleotide exchange factor), in Arf1 den Nukleotidaustausch von GDP nach GTP. Das nun in seinen aktiven Zustand überführte Arf1-GTP exponiert nach einer Konformationsänderung eine N-terminale amphiphatische Helix und einen Myristoylanker und bindet über diese fest an die Membran. Im Anschluss definieren Arf1-GTP und p23 bzw. p24 den sogenannten „priming complex“, über welchen das Hüllprotein Coatomer aus dem Cytosol an die Membran rekrutiert wird, was letztendlich zur Ausbildung eines COPI-Vesikels führt. Im Rahmen dieser Arbeit ist es nun erstmals gelungen, das für die COPI-Vesikelbiogenese physiologisch relevante Arf GEF GBF1, mit einem Molekulargewicht von ungefähr 200 kDa, im baculoviralen System zu exprimieren und anschließend aufzureinigen. Das rekombinante GBF1 wurde hinsichtlich seiner Fähigkeit charakterisiert, an isolierte Golgi-Membranen zu binden und an Arf1 den Nukleotidaustausch von GDP zu GTP durchzuführen. Zusätzlich wurde eine bereits beschriebene Interaktion von GBF1 mit Coatomer nachgewiesen, die in der hier vorliegenden Arbeit auf bestimmte Coatomer-Isotypen weiter eingegrenzt werden konnte. Durch Photokreuzvernetzungsstudien wurde eine direkte Interaktion von GBF1 mit p23 nachgewiesen. Sich daran anschließende Kompetitions- und Koimmunpräzipitations-Experimente zeigten, dass neben p23 auch die p24 Proteinfamilienmitglieder p24, p25, p26 und p27 in jeweils dimerer Form mit GBF1 interagieren. Wurde Arf1 in die Koimmunpräzipitations-Experimente eingeschlossen, so zeigten sich trimere Komplexe bestehend aus Arf1, GBF1 und dimeren Mitgliedern der p24 Familie. Mit Hilfe von Tryptophan Fluoreszenz Messungen in einem löslichen und liposomalen System wurde anschließend die Aktivität von GBF1 an Arf1 in der Gegenwart von monomeren und dimeren p24 Familienmitgliedern untersucht. Dabei zeigte sich, dass nur dimere p23, p24 und p27 die Aktivität von GBF1 inhibieren. Entsprechend fand sich in in vitro Experimenten eine verringerte Ausbeute an COPI-Vesikeln in der Gegenwart von p27. Neben der Inhibition von GBF1 sind p23, p24 und p27 wahrscheinlich auch für eine Inhibition der ArfGAP1 (GTPase-activating protein)-vermittelten GTP-Hydrolyse an Arf1 verantwortlich. Mit dem hier generierten, rekombinanten GBF1 steht nun eine weitere, physiologisch relevante Komponente der COPI Maschinerie für Interaktions- und Aktivitätsstudien zur Verfügung, wodurch diese Arbeit einen wichtigen Schritt zur vollständigen Aufklärung der COPI-Vesikelbiogenese liefert.

Translation of abstract (English)

In the initial step of COPI vesicle biogenesis the small GTPase Arf1 is recruited to the membrane via direct interaction with p23 and p24 both members of the p24 family of type I transmembrane proteins. There GBF1 (Golgi-specific brefeldin A-resistance factor 1), an Arf guanine nucleotide exchange factor (Arf GEF), mediates the nucleotide exchange on Arf1 from GDP to GTP. Subsequently the active Arf1-GTP binds tightly to the membrane through its N-terminal amphiphatic helix and myristoyl anchor and dissociates from p23 or p24. Finally coatomer is recruited from the cytosol to the membrane en bloc leading to the formation of a COPI vesicle. Here the expression and purification of recombinant full-length GBF1 (200 kDa) which is the physiologically relevant Arf GEF for the COPI vesicle biogenesis was established. GBF1 was characterised by its ability to bind to isolated Golgi membranes. An already described interaction of GBF1 and coatomer was verified and showed furthermore preferences for specific coatomer isotypes. Beside this, an interaction of p23 with GBF1 was observed by using photocrosslinking approaches. Subsequent competition and coimmunprecipitation experiments revealed in addition all dimeric members of the p24 family as interaction partners of GBF1. Also trimeric complexes consisting of Arf1, GBF1 and dimeric members of the p24 family were shown to exist. Tryptophan fluorescence measurements detecting the nucleotide exchange activity of GBF1 on Arf1 were performed in the presence and absence of monomeric and dimeric p24 family members while using a completely soluble system and a liposomal system. GBF1-mediated nucleotide exchange on Arf1 was significantly inhibited by dimeric p23, p24 and p27. This observation is consistent with the finding that less COPI vesicles are formed in the presence of dimeric p27. In addition evidence is reported that the hydrolysis of GTP by ArfGAP1 (GTPase-activating protein) on Arf1 is also inhibited by p23, p24 and p27. In this study recombinant GBF1, a physiological relevant component of the COPI machinery, was generated. Further interaction and activity studies will be provide an important step towards the full elucidation of the initial steps in the biogenesis of COPI vesicles.