English Title: Establishment of transfection techniques for functional gene analysis in the freshwater polyp hydra

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Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es transgene Hydren sowie transgene Stammzelllinien zu erzeugen. Hierfür wurden drei biotechnologische Ansätze untersucht. Im ersten Ansatz konnten durch embryonale Mikroinjektion eines Reporterkonstrukts, das GFP unter Kontrolle eines konstitutiv aktiven Hydra Aktin Promotors enthielt, transgene Polypen erzeugt werden, das zu drei transgenen Stammzelllinien führte: GFP+ I-Zellen, GFP+ Endoderm und GFP+ Ektoderm. Mit Hilfe der GFP+ I-Zelllinie konnten durch Transplantationsexperimente Proliferations- und Differenzierungsprozesse der Stammzellen studiert werden. Hierbei zeigte sich, dass hauptsächlich bereits differenzierende I-Zellen eine Motilität im Polypen aufweisen, welche überwiegend in Nervenzellen differenzierten. Mit erzeugten transgenen epithelialen Polypen konnten frühe Zellsortierungsprozesse in Hydra-Reaggregaten analysiert werden. Hierbei konnten Endodermzellen als treibende Kraft bei der Ausbildung homotypischer Gewebe determiniert werden, wobei die Zellclusterbildung eine exponentielle Dynamik aufwies. Ein zweiter Ansatz basierte auf dem Transposonsystem „Sleeping Beauty“ und einem Meganuklease-assistierten Ansatz. Im Vergleich mit Kontrollen war ein positiver Effekt dieser Ansätze nicht erkennbar. In einem dritten Ansatz beschäftigte sich diese Arbeit mit der Etablierung einer neuen Transfektionstechnik für Hydra Polypen. Durch intraepitheliale Mikroinjektion und Elektroporation konnte diese erfolgreich etabliert werden. Über den Ort der Mikroinjektionsstelle am Polypen können dadurch transient Zellen in einem frei wählbaren lokal begrenzten Gewebebereich transfiziert werden. Es konnten Protokolle etabliert werden, die entweder zu ektodermalen Epithelzell-Clustern mit mehr als 10 Zellen führen können oder alternativ I-Zellen und deren Derivate transfizieren. Mithilfe dieser Transfektionstechnik konnte die Differenzierung individuell transfizierter I-Zellen verfolgt werden. Hierbei ergaben sich Hinweise, die eine frühe Festlegung der I-Zellen, vermutlich im Ein-Zellstadium, auf einen Differenzierungsweg bestätigen. Weiterhin bestätigte sich, dass Positionsinformationen im Polyp einen Einfluss auf die Differenzierung der I-Zellen haben. So differenzierten nach lokaler Transfektion am Kopfbereich alle I-Zellen zu Nervenzellen, während sie im Rumpf auch zu Desmonemen differenzierten. Weiterhin eröffnet diese Transfektionstechnik neue Möglichkeiten um funktionelle Studien mit transienter Überexpression am Polypen durchzuführen. In dieser Arbeit wurden zur funktionellen Analyse des Hydra-Kopforganisators Vektoren vorbereitet, welche Komponenten des Wnt-Signalwegs (HyWnt3, dominant-negatives TCF und beta-Catenin) unter der Kontrolle eines konstitutiv aktiven Promotors, den Hydra Aktin Promotor, enthalten.

Translation of abstract (English)

My thesis focuses on the generation of transgenic hydra and transgenic i-cell lineage. To reach this aim, three different biotechnological approaches have been studied. The first approach was to generate transgenic hydra using the embryonic microinjection technique. The application of a reporter plasmid containing GFP under control of a constitutive active Hydra actin promoter led to three transgenic stem cell lineages: GFP+ i-cell lineage, GFP+ endoderm and GFP+ ectoderm. Proliferation and differentiation processes of i-cells could be studied by grafting experiments with the i-cell lineage. These experiments revealed that, in the main, already committed cells show a higher mobility and differentiate mostly into neurons. Furthermore, early cell-sorting processes in hydra reaggregates have been observed and analyzed by using transgenic epithelial cell lineages. The conclusion of these experiments is that endodermal cells have a higher affinity to homotypic cell-cell contacts than to ecto-ecto cell contacts. However, endodermal cells seem to be the driving force in the cell sorting process because they start to cluster to each other with exponential dynamics. The second approach was based on the optimization of transfection by the use of the transposon „Sleeping Beauty“ and a meganuclease-based transfection. The application of these techniques showed no detectable influence when compared to controls. In a third approach, a new transfection technique for Hydra polyps was successfully established via a combination of intraepithelial microinjection and electroporation. It allows for the transient cell-type-specific transfection in a localized area of the polyp. Electroporation protocols could be established for both epithelial and i-cell transfection. The application of this technique revealed that transfected i-cells differentiate according to their position, e.g. transfected i-cells close to the head differentiated only into neurons. Furthermore, the analysis of single i-cells showed evidence that commitment to a certain fate happens early, most probably as single cells. In addition, the established transfection technique for polyps offers new opportunities to study genes of interest with gain-of-function experiments. Several candidates of the Wnt-signalling pathway (HyWnt3, beta-catenin, dominant-negative Tcf) were cloned under the control of a Hydra actin promoter which can be used in future experiments.