English Title: Characterisation of the Structural and Functional Interaction between the Feline Foamyvirus Bet-Protein and the Cellular APOBEC3-Protein

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Abstract

Die Analyse der genomischen APOBEC3-Region der Hauskatze (F. catus) ergab, dass sich die chromosomale APOBEC3-Loci von Primaten, Nagetieren und Hunden wesentlich unterscheiden (Münk et al., 2008). Drei Kopien des feA3C-Genes wurden auf dem Chromosom B4 lokalisiert. Sie codieren für drei feA3C-Isoformen, die sich in 6 bzw. 7 Aminosäuren voneinander unterscheiden. Neben dem Nachweis von drei sehr ähnlichen feA3C-Genen und einem feA3H-Gen wird post- transkriptionell durch alternatives Spleißen ein zwei-Domänen feA3CH-Protein als Fusionsgen gebildet. Diese feA3-Proteinfamilie bildet als Teil der angeborenen Immunantwort einen entscheidenden antiviralen Abwehrmechanismus und inhibiert die Replikation Bet-defizienten felinen Foamyvirus sowie Vif-defizienten Katzenimmundefizienzvirus. Ein elementarer Bestandteil der Arbeit war die Untersuchung der Expression endogener feA3-Proteine in Katzenzellen sowie die Analyse ihrer antiviralen Aktivität und der Interaktion mit foamyviralen Bet- und Gag-Proteinen. Die Expression des zwei-Domänen feA3CH-Proteins wurde in CrFK- und Mya- Zellen nachgewiesen, während feA3C- und -H-Proteine nur in CrFK-Zellen nachweisbar waren. Die spezifische antivirale Aktivität der einzelnen feA3-Hauptformen gegen Bet-deletiertes FFV sowie ihre Interaktionen mit FFV-Bet und FIV-Vif zeigen, dass Vif die proteasomale Degradation aller feA3s induziert während Bet lediglich an alle feA3-Proteine bindet. Die Bet-feA3-Komplexbildung inhibiert die Inkorporation der feA3C und -CH-Proteine in FFV-Partikel. Dabei korreliert die Interaktion der C-Domäne der feA3-Formen mit FFV-Gag mit der Inkorporation in Virionen Bet-defizienter FFV-Genome. Offen ist ob Bet die Komplexbildung mit feA3 sequestriert, die Gag-feA3-Bindungsstelle maskiert oder der Nicht-Inkorporationsphänotyp von Bet auf das gebundene feA3 übertragen wird. Ein intaktes strukturelles Zentrum von feA3C-a ist essentiell für den antiviralen Effekt während die Veränderung des katalytischen Zentrums die Inkorporation verhindert. Sowohl die Mutation des katalytischen Zentrums als auch einer strukturell wichtigen Aminosäure im feA3C-a haben einen Verlust der antiviralen Aktivität gegen Bet-defizientes FFV zur Folge. Die Aminosäuren des katalytischen Zentrums von feA3C-a sind für die Interaktion mit FFV-Gag essentiell. Die funktionelle Komplementarität der viralen Abwehrfaktoren Bet und Vif zur Wiederherstellung des foamyviralen Titers führten zur Konstruktion eines chimären pCF7-Vif-Vektors, der durch in vitro- Selektion optimiert wurde. Durch seinen stabilen Titer in seriellen Langzeitpassagen bildet dieser Vektor eine geeignete Grundlage für die Entwicklung eines Vakzinevirus gegen FIV. In dieser Arbeit wurde der foamyvirale Abwehrmechanismus gegen ein Protein der angeborenen Immunantwort auf molekularer Ebene aufgeklärt. Aufbauend auf diesen funktionellen Grundlagenstudien wurde ein chimäres Vakzinevirus entwickelt, das das FIV-Vif-Immunogen und (weitere Antigene) im Kontext des apathogenen FFV Vektorgenoms exprimieren kann.

Translation of abstract (English)

The analysis of the genomic APOBEC3-region in the domestic cat (F. catus) revealed a chromosomal APOBEC3-locus that considerably differs between primates, rodents and canines (Münk et al., 2008). Three copies of the feA3C-genes were discovered, that are positioned on the chromosome B4 in a head-to-tail-formation. They code for three feA3C-isoforms that differ in 6 to 7 amino acids. Besides the confirmation of thee very similar feA3C-genes and one feA3H-gene a two-domain feA3CH is build post-transcriptionally and by alternative splicing. This results in a two-domain feA3CH-proteine in contrast to the one-domain feA3C and -H. This feA3-proteine-family works as a part of the innate immune response and inhibits the replication of Bet-deficient FFV and Vif-deficient FIV as a crucial part of the viral defence-factor. One basic component of this thesis was the investigation of the expression of endogenous feA3- proteins in cat cells and the analysis of their antiviral activity as well as their interaction with foamyviral Bet- and Gag-proteins. Thereby the two domain feA3CH-proteins were detected in CrFK- and Mya- cells, whereas feA3C- and H-proteins were only detected in CrFK-cells. This specific antiviral activity of the single feA3-C-, -H- and CH-proteins against Bet-deleted FFV as well as their interaction with FFV-Bet and FIV-Vif lead to the formulation of a Bet-dependent foamyviral defence mechanism. This mechanism differs basically from the mechanism of a Vif-induced feA3-degradation. In this defence model Bet inhibits the feA3-Gag-interaction and the particle incorporation, which is essential for their antiviral activity. Both mutations in the catalytically centre as well as the in structurally important amino acid in the feA3C-a-protein lead to a loss of the antiviral activity against Bet-deficient FFV. The interaction of feA3C-a with FFV-Gag is solely caused by the amino acid in the catalytically centre of feA3C-a. The finding of the compatibility of the viral defence factors Bet and Fiv for the foamyviral titre rescue lead to the construction of a chimeric pCF7-FIV-vector that was optimised by in vitro selections. This vector shows a stable titre in long-term passages and an adequate fundament for the development of a vaccine virus against FIV. In this work the foamyviral defence mechanism against a protein of the innate immunity was solved on the molecular basis. Based on these functional studies a chimeric vaccine virus was developed that expresses the immunogenic FIV-Vif and further antigens in an apathogenic vector genome.