English Title: Examinations for the meaning of the nukleosid kinase B for the expression of heterotrimeric G-Proteins in zebrafishembryos

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Abstract

Der Gehalt des Enzyms Nukleosid-Diphosphat-Kinase (NDPK) ist Plasmamembranen aus chronisch insuffizienten Herzen um 300% höher als in Plasmamembranen gesunder Herzen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die NDPK B-Isoform des Enzyms in der Plasmamembran Komplexe mit G-Protein-betagamma-Dimeren (Gbetagamma) bildet, die heterotrimere G-Proteine über eine Phosphattransfer-Reaktion aktivieren können. Unklar ist jedoch, welche Rolle diese Komplexbildung aus NDPK B und Gβgamma für die Funktion des Herzens spielt. In dieser Arbeit wurde deshalb im in-vivo-Modell des Zebrafischembryos die Expression der im Herzen dominanten NDPK-Isoformen, NDPK A und B sowie der human Orthologen der Gbeta1-Untereinheiten, Gbeta1 und Gbeta1like, mittels Morpholino-Injektion ausgeschaltet und die Herzfunktion im Vergleich zu Wildtyp- bzw. kontrollinjizierten Zebrafischembryonen untersucht. Die Abnahme der NDPK- bzw. Gbeta1-Expression wurde 72 Stunden nach Morpholino-Injektion im Immunoblot und NDPK-Aktivitäts-Assay nachgewiesen. Die Depletion der NDPK B, nicht aber der Isoform A, verursachte einen kardialen Phänotyp, der durch eine deutlich verminderte Pumpfunktion, verminderten Blutfluss und einen Defekt in der Gefäßbildung gekennzeichnet war. Dabei zeigten histologische Färbungen und Immunhistologie eine strukturell intakte Entwicklung des Herzens. Als Folge des Knockdowns der NDPK B konnte eine deutliche Reduktion der Expression der Gbeta1- und Ggamma2-Untereinheiten, sowie der alpha-Untereinheiten von Gs-, Gi-, Gq- und G12-Proteinen beobachtet werden. Der Gehalt an mRNAs, die für die untersuchten Proteine kodieren, war dagegen unbeeinflusst. Der Morpholino-induzierte Knockdown der Gbeta-Untereinheiten Gbeta1 und Gbeta1like zeigte einen ähnlichen hypokontraktilen Phänotyp. Wie beim NDPK B-Knockdown konnte ein Verlust von Galphas, Galphai, Galphaq, Galpha12, Ggamma2 sowie der NDPK B beobachtet werden. Die Daten dieser Arbeit belegen deshalb erstmalig die essentielle Rolle des NDPK B/Gbetagamma-Komplexes für eine normale Kontraktilität des Herzens in vivo. Der erhöhte Plasmamembrangehalt an NDPK im chronisch insuffizienten Herzen könnte deshalb von erheblicher physiologischer Bedeutung sein.

Translation of abstract (English)

In human heart failure, nucleoside diphosphate kinase (NDPK) is elevated by 300% at the plasma membrane. Specifically, the NDPK B isoform is complexed with G protein betagamma(Gbetagamma) dimers. However, the role of this NDPK B/Gbetagamma complex in heart function remains unclear. Zebrafish embryos were used in this study as an in vivo model, to assess the cardiac function resulting from a selective knockdown of zebrafish orthologs of the dominant NDPK isoforms A and B as well as the both Gbeta1-subunits Gbeta1 and Gbeta1like by injection of morpholino antisense oligos compared to control-injected wild-type embryos. Reduced expression of the highly conserved NDPK or Gbeta proteins was confirmed 72 hours after injection by immunoblot and NDPK activity analysis of zebrafish lysate. Depletion of NDPK B, but not NDPK A, led to severely compromised atrial and ventricular cardiac function associated with pericardial edema, insufficient blood flow and impaired vasculogenesis. Histology (HE stain) and immunofluorescence staining revealed intact development and no structural defects in the knockdown hearts. As a consequence of the NDPK B depletion, a nearly complete loss of Gbeta1 and Ggamma2 proteins as well as alpha-subunits of Gs, Gi, Gq and G12 proteins was detected, whereas the mRNA content of all non targeted proteins remained unaffected. Depletion of the zebrafish Gbeta-subunits Gbeta1 and Gbeta1like caused a similar phenotype with comparable impaired cardiac contractility. Like the depletion of NDPK B, the knockdown of Gbeta1/1like was associated with a loss of Galphas, Galphai, Galphaq, Galpha12, Ggamma2 and, most importantly, NDPK B. Taken together, the data show an essential role for the interaction of NDPK B with Gbetagamma dimers to maintain G protein expression and thus normal cardiac contractility in vivo. Thus, an increased membranous NDPK level in the failing heart is likely to have important functional implications.