German Title: Tropical - Software zur quatitiativen Analyse von FRAP Experimenten

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Abstract

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments using laser scanning microscopes to follow the in vivo dynamics of proteins tagged to fluorescent markers like the green fluorescent protein (GFP) has become a standard method in cell biology. FRAP perturbs the fluorescence distribution by photobleaching GFPtagged proteins in a specific area of a cell and monitors the fluorescence redistribution. Adequate methods to quantify the results of FRAP experiments have recently became available. Those methods allow the extraction of diffusion coefficients and dissociation constants of proteins diffusing inside distinct cellular compartments and undergoing dynamic binding and dissociation with immobile or mobile binding sites. However, software incorporating such methods was not available until now. Therefore I developed Tropical, a software for simulation and parameter estimation of reaction–diffusion models. Based on spatio-temporal microscopy images, Tropical estimates reaction and diffusion coefficients for user-defined models. Tropical allows the investigation of systems with an inhomogeneous distribution of molecules, making it well suited for quantitative analyses of microscopy experiments such as FRAP. Tropical was used in this thesis to analyze the dynamic behavior of linker histone H1°, which plays a crucial role in the dynamic organization of chromatin by stabilizing the nucleosome, a structure involved in DNA packing in eucaryotic cells. FRAP experiments were performed using three forms of linker histone H1°, the wild type, and two forms with mutated sites, that are likely to play a major role in DNA binding. Diffusion coefficients on the three forms were estimated with Tropical by fitting a pure diffusion model, assuming binding to happen instantaneously. The model showed a very good fit to the experimental data. It could be shown that lysine 52 significantly influences the DNA binding properties of H1° and its mutation resulted in a 3-fold enhanced diffusion coefficient. The H1° form containing six point mutations however showed an even higher diffusion coefficient, about 15 times higher than the one of the wild type histone, revealing a much larger contribution to DNA binding of these six mutated sites. Using Tropical to estimate the diffusion coefficients of linker histone H1° was another proof for the power and functionality of Tropical, besides the recently published one (Ulrich et al. 2006). Tropicals’ main advantages are (1) that it directly operates on microscopy images, (2) an inhomogeneous distribution of binding partners can be considered and (3) the obtained result can directly be verified. This thesis will first line out the current knowledge of eucaryotic chromatin organization, to clarify the role of linker histone H1. I will then give an overview of microscopy techniques available to reveal protein dynamics and their quantitative analysis using mathematical models. The next part will explain Tropical and its implemented methods in detail. Finally I will present the results obtained on the dynamics of H1° and critically discuss the applicability of Tropical to analyze FRAP data and FRAP as a method to reveal protein dynamics.

Translation of abstract (German)

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) ist inzwischen eine Stardardmethode der Zellbiologie zur Visualisierung des dynamischen Verhaltens von fluoreszenzmarkierten Proteinen in vivo. Mittels FRAP wird die Fluoreszenzverteilung der markierten Proteine durch Photobleichen in einem bestimmen Bereich der Zelle gestört. Das Widerherstellen der Fluoreszenzverteilung wird mittels Laserscanning Mikroskopie aufgezeichnet. Jüngst wurden geeignete Methoden zur quantitativen Analyse der gewonnen Daten entwickelt, mittels welcher es möglich ist Diffusionskoeffizienten und Dissoziationskonstanten von beweglichen Molekülen, die dynamische Bindungen mit unbeweglichen oder beweglichen Bindungsstellen eingehen, abzuschätzen. Geeignete Software, zur Umsetzung dieser Methoden war jedoch bis heute nicht erhältlich. Darum entwickelte ich Tropical, eine Sofware zur Simulation und Parameterschätzung basierend auf Reaktions-Diffusionsmodellen. Mittels räumlich-zeitlicher Mikroskopiebilder schätzt Tropical Reaktions- und Diffusionskonstanten von benutzerdefinierten Modellen. Auch inhomogene Molekülverteilungen können analysiert werden, was Tropical zu einem geeigneten Tool zur quantitativen Analyse von FRAP Experimenten macht. Tropical wurde in dieser Arbeit verwendet, um das dynamische Verhalten von Linkerhiston H1° zu untersuchen. Dieses stabilisiert das Nukleosom, eine Struktur, die wichtig für die Komprimierung von DNA ist und daher eine bedeutende Aufgabe bei der dynamischen Organisation von Chromatin in eukaryotischen Zellen hat. FRAP Experimente wurden mit Wildtyp Linkerhiston H1° und zwei Formen mit Mutationen an möglichen DNA Bindungsstellen durchgeführt. Mit Tropical wurden die Diffusionskoeffizienten der drei Formen geschätzt, basierend auf einem Diffusionsmodell unter Annahme sehr schneller Bindungsreaktionen. Das Modell zeigte eine sehr gute Übereinstimmung zu den experimentellen Daten. Die Stelle Lysin 52 hatte einen starken Einfluss auf das DNA-Bindungsverhalten von H1°. Das Resultat der Mutation dieser Stelle war ein dreifach erhöhter Diffusionskoeffizient. Die H1° Variante mit sechs verschiedenen Punktmutationen zeigte sogar einen 15-fach erhöhten Diffusionskoeffizienten, was auf einen noch größeren Einfluss auf das DNABindungsverhalten deutet. Die Verwendung von Tropical zur Untersuchung der Dynamik von H1° war, nach dem jüngst publizierten (Ulrich et al. 2006), ein weiterer Beweis für seine Eignung zur Analyse von FRAP. Die Vorteile von Tropical sind, dass (1) es direkt mit Mikroskopie Bildern arbeitet, (2) auch inhomogene Verteilungen berücksichtigt und (3) die gewonnen Ergebnisse direkt validiert werden können. In der vorliegenden Arbeit wird zunächst der aktuelle Wissensstand der Chromatinorganisation in eukaryotischen (Ulrich et al. 2006) Zellen dargestellt und die Rolle von Histon H1 hierbei erklärt. Danach folgt eine Einführung in die verfügbaren Mikroskopietechniken zur Visualisierung von Proteindynamiken und in die mathematischen Methoden zu deren quantitativen Analyse. Im darauf folgenden Teil werde ich Tropical und die darin verwendeten Methoden detailliert darstellen und schließlich die Ergebnisse meiner Untersuchungen zur Dynamik von Linkerhiston H1° präsentieren und kritisch diskutieren. Auch die Eignung von Tropical zur Analyse von FRAP Experimenten sowie von FRAP zur Untersuchung von Proteindynamiken wird schließlich kritisch beleuchtet.