German Title: Genom-breit Charakterizierung des Kompliziertes Hefe Transkriptom Architektur mit "tiling arrays"

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Abstract

Recent genome-wide transcriptome analysis in humans, Drosophila, Arabidopsis and yeast challenged the old notion of fundamental aspects of gene regulation, providing evidence that protein-encoding genes are not the only agents controlling cellular processes. Non-coding RNAs comprising untranslated regions of protein coding genes, antisense transcripts of annotated genes, micro RNAs and small interfering RNAs present another tier in gene regulation, enabling integration and networking of complex suites of gene activity. Sophisticated RNA signaling networks operate in higher eukaryotes, enabling gene to gene communication and regulation of chromatin structure, DNA methylation, transcription, translation, RNA silencing and stability, and coordinate multiple tasks of the whole cellular system. Fundamental mechanisms and structure of such control architecture remained largely obscure due to limitations of available approaches, such as noise in the data, strand–unspecific transcription analysis and difficulties in functional follow-up opportunities in higher eukaryotes. To address the complexity of transcriptome architecture we undertook the genome-wide transcriptome study in a simpler genome of S.cerevisiae with the help of a new tiling array. We have shown that 85% of the genome is expressed in rich media. Apart from expected transcripts, we found operon-like transcripts, transcripts from neighboring genes not separated by intergenic regions, and genes with complex transcriptional architecture where different parts of the same gene are expressed at different levels. We mapped the positions of 3' and 5' UTRs of coding genes and identified hundreds of RNA transcripts distinct from annotated genes. These non-annotated transcripts, on average, have lower sequence conservation and lower rates of deletion phenotype than protein coding genes. Many other transcripts overlap known genes in antisense orientation, and for these pairs global correlations were discovered: UTR lengths correlated with gene function, localization, and requirements for regulation; antisense transcripts overlapped 3' UTRs more than 5' UTRs; UTRs with overlapping antisense tended to be longer; and the presence of antisense associated with gene function. Overall our study revealed complexity of yeast transcriptional architecture calling for additional annotation of the genome and putting forward an important role for RNA-mediated regulation. An attractive model for the study of the genome-wide RNA-mediated regulation of gene activity in yeast is mitotic cell cycle, which has been extensively studied over past decade and is therefore a well characterized system. Mitosis is associated with important physiological changes in the cell and diverse biological events depend on this periodicity. To ensure the proper functioning of the mechanisms that maintain order during cell division about 800 genes of diverse GO categories are coordinately regulated in a periodic manner coincident with the cell cycle. This includes genes involved in DNA replication, budding, glycosylation, nuclear division, control of mRNA transcription, responsiveness to external stimuli and subcellular localization of proteins. Several genome-wide studies have been done to catalogue cell cycle-regulated genes with the help of early expression arrays. Given the high resolution of our technique, profiling genome-wide periodic expression with the tiling arrays allowed taking a step forward to prove the existence of RNA-mediated regulation of transcription. Using two methods of synchronization, I have monitored cell-cycle dependent transcription for more than 3 complete cell cycles. I have identified about ~600 periodic ORFs. In consent with previous studies on transcriptional regulation during specific mitotic phases, I have shown prevalence of periodic expression of annotated genes in three distinct periods of cell cycle progression: late G1/S transition, G2/M transition and exit of M phase of mitosis. Moreover, I have shown antisense transcription throughout the cell cycle phases. Out of ~260 antisense transcripts that we discovered, 37 display periodic patterns; half of them are expressed coincidentally with peak expression intensity of cell cycle-regulated ORFs, whereas the other half peaks at the periods of relaxation of the transcriptional machinery, which drives phase transition. Cycling antisense has been registered opposite several important cell cycle regulators. Additionally, periodic novel isolated transcripts were detected in the dataset, which may represent non-annotated ncRNAs involved in regulation of mitosis or regulated by cell cycle controlling genes.

Translation of abstract (German)

Neueste genomweite Transkriptom-Analysen im menschlichen Genom, in Drosophila, Arabidopsis und Hefe, stellen die alte Auffassung von den fundamentalen Aspekten der Genregulation in Frage und liefern Beweise dafür, dass Protein-Codierende Gene nicht die einzigen Vermittler sind zelluläre Prozesse zu kontrollieren. Nicht-Kodierende RNAs welche untranslatierte Regionen Protein-Codierender Gene, Antisense-Strang Transkripte annotierter Gene, micro RNAs und ‘small interfering’ RNAs umfassen, stellen eine weitere Stufe der Genregulierung dar und ermöglichen die Integration und Vernetzung komplexer Abfolgen der Genaktivität. In höheren Eukaryoten operieren ausgeklügelte RNA Signal-Netzwerke und ermöglichen ihnen eine Gen zu Gen Kommunikation und Regulation der Chromatin-Struktur, der DNA-Methylation, der Transkription, der Translation, ‘RNA-silencing’ und Stabilisierung und koordinieren zudem verschiedene Aufgaben des gesamten zellulären Systems. Fundamentale Mechanismen und Strukturen solcher Kontroll-Einrichtungen blieben weitgehend ungeklärt. Grund dafür waren Einschränkungen in vorhandenen Methoden wie das Störungs-Rauschen in Datensätzen, Strang-unspezifische Transkriptions-Analysen und Schwierigkeiten in funktionellen Folge-Untersuchungen in höheren Organismen. Um die komplexe Transkriptom-Architektur zu untersuchen führten wir mit Hilfe des neuen ‘tiling array’ eine genomweite Transkriptom-Studie des einfacheren Genoms der S.cerevisiae durch. Wir demonstrierten das 85% des Genoms in reichhaltigem Medium exprimiert ist. Neben den erwarteten Transkripten fanden wir Operon-ähnliche Transkripte, Transkripte von benachbarten Genen die nicht durch intergenetische Regionen getrennt sind und Gene mit komplexem transkriptionellem Aufbau bei denen verschiedene Teile eines Gens unterschiedlich stark exprimiert sind. Wir kartierten die Positionen der 3’ und 5’ untranslatierten Regionen (UTRs) der codierenden Gene und identifizierten hunderte von RNA Transkripten die nicht zu annotierten Genen zählten. Diese nicht-annotierten Transkripte zeigen im Durchschnitt eine niedrigere Sequenzkonservierung und geringere Raten an Deletions-Phänotypen als Protein-Codierende Gene. Viele andere Transkripte überlappen Gene in antisense Orientierung. Insgesamt betrachtet offenbart unsere Studie einen komplexen Aufbau der Hefe- Transkription die eine zusätzliche Annotierung des Genoms einfordert und eine wichtige Rolle für die RNA-vermittelte Genregulation vorantreibt. Ein attraktives Model zur Studie der genomweiten RNA-vermittelten Regulation der Genaktivität in Hefe ist der mitotische Zellzyklus, der während der letzten Dekade intensiv erforscht wurde und daher ein gut charakterisiertes System darstellt. Die Mitose ist mit wichtigen physiologischen Veränderungen in der Zelle assoziiert und verschiedene biologische Ereignisse sind von dieser Periodizität abhängig. Circa 800 Gene der verschiedensten GO Kategorien sind koordiniert in einer periodische Weise reguliert, übereinstimmend mit dem Zellzyklus, um eine exakte Funktion des Mechanismus der die Ordnung während der Zellteilung gewährt, zu ermöglichen. Diese beinhalten Gene in der DNA Replikation, Knospung, Glykosilierung, Kernteilung, Kontrolle der mRNA Transkription, Empfindlichkeit für externe Stimuli und subzelluläre Lokalisierung von Proteinen. Einige genomweite Studien wurden unternommen um Zellzyklus regulierte Gene mit Hilfe von frühen Expressions-Arrays zu katalogisieren. Bestimmt durch die hohe Auflösung unserer Technik, hat uns die genomweite Profilierung periodischer Expression mit den ‘tiling arrays’ es uns ermöglicht einen Schritt weiter zu gehen und die Existenz der RNA-vermittelten Regulation der Transkription zu beweisen. Unter Anwendung von zwei verschiedenen Methoden der Synchronisierung habe ich die Zellzyklus abhängige Transkription für mehr als drei vollständige Zellzyklen aufgezeichnet. Ich habe ca. 600 periodische ORFs identifiziert. Übereinstimmend mit früheren Studien der transkriptionellen Regulierung während spezifischer mitotischer Phasen konnte ich eine Anhäufung der periodischen Expression von annotierten Genen in drei verschiedenen Perioden des Zellzyklus aufzeigen: Später G1/S Übergang, G2/M Übergang und Übergang von M Phase zur Mitose. Darüber hinaus zeigte ich antisense Transkription während aller Zellzyklus Phasen. Von ca. 260 antisense Transkripten die entdeckt wurden zeigen 37 ein periodisch wiederkehrendes Muster; die Hälfte von ihnen deckt sich mit der höchsten Expressions-Intensität von Zellzyklus regulierten ORFs, während die andere Hälfte die höchste Expression zeigt während die Transkriptions-Maschinerie in einer Ruhephase ist, welches den Phasenübergang antreibt. Zusätzlich konnten neue periodische Transkripte in dem Datensatz identifiziert werden. Diese könnten nicht annotierte nicht-codierende RNAs repräsentieren die in der Regulation der Mitose involviert sind, oder die durch Zellzyklus-kontrollierende Gene kontrolliert werden.