German Title: Analyse der nukleolären Funktionen in dopaminergen Neuronen sowie bei der Parkinsonschen Erkrankung, durch gezielte Inaktivierung des Transkriptions-Initations-Faktor IA

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Abstract

Die bekannteste neurodegenerative Krankheit, welche mit dem Verlust von dopaminergen Neuronen zusammenhängt, ist die Parkinsonsche Erkrankung. Das Hauptmerkmal dieser Krankheit ist der langsam fortschreitende Verlust der dopaminergen Neuronen. Dieser Verlust führt zu einer Verminderung der Dopaminkonzentration im Striatum, welche verantwortlich ist für motorische Störungen wie Muskelstarre, Muskelzittern und Bewegungsarmut. Obwohl die pathologischen Veränderungen sehr genau beschrieben sind, ist der zugrundeliegende Mechanismus nicht bekannt. Jedoch haben Studien gezeigt, dass erhöhter oxidativer Stress in dopaminergen Neuronen die Schlüsselrolle bei der Entstehung der Parkinsonschen Krankheit einnimmt. Zellen registrieren diesen Stress mit Hilfe spezifischer Sensoren wie bspw. des Nukleolus, welcher auf wachsenden oxidativen Stress mit der Stabilisierung des Transkriptionsfaktor p53 reagiert. Das Ziel dieser Arbeit ist, die Funktion des Nukleolus in dopaminergen Neuronen bei der oxidativen Stress-Antwort zu ermitteln, sowie dessen Rolle bei der Parkinsonschen Erkrankung. Durch das Nervengift 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) ausgelöste Erhöhung des oxidativen Stress, führte zu einer Beeinträchtigung der nucleolären Struktur sowie zu einer starken Reduktion der Transkriptionsrate der ribosomalen DNA. Es wurde gezeigt, dass die Regulation der rDNA-Transkription hauptsächlich durch den Transkriptions-Initiations-Faktor-IA (TIF-IA) erfolgt, welcher für die Abstimmung der biosynthetischen Aktivität der Zelle auf die jeweiligen Umgebungsbedingungen verantwortlich ist. Um die Funktionen des Nukleolus dabei näher untersuchen zu können, wurden Mausmutanten mit Hilfe des Cre/loxP Rekombinationssystems erzeugt (TIF-IADATCre), bei denen die Funktion des Nukleolus durch die Inaktivierung des TIF-IA Gens in dopaminergen Neuronen beeinträchtigt wurde. Diese Mutation führte zu einem langsamen Absterben der dopaminergen Neurone, reduziertem Dopamingehalt im Striatum und einer daraus resultierenden beeinträchtigten Motorik, welche die Symptome der Parkinsonschen Erkrankung widerspiegelt. Bemerkenswerterweise führt der Verlust von nukleolärer Funktion zu einer direkten Beeinträchtigung der mitochondrialen Aktivität, weit früher als die ersten strukturellen Veränderungen sichtbar werden. Um diese Sachlage näher analysieren zu können, wurden Mausmutanten, in denen zu einem festgelegten Zeitpunkt die Inaktivierung des TIF-IA Gens erfolgt, hergestellt (TIF-IADATCreERT2). Unter Zuhilfenahme einer Cre Reporter Mauslinie wurde die hohe Spezifität der Expression des Transgenes (DATCreERT2), sowie dessen geringe Hintergrundaktivität nachgewiesen. Die Aktivierung des Ablationssystems führt zu einer Beeinträchtigung der nukleolären Funktionen, dann zu p53 Hochregulation, gefolgt von mitochondrialer Beeinträchtigung und steigendem oxidativen Stress, welcher schließlich zu einem progressiven Verlust von dopaminergen Neuronen führte. Ferner wurde durch TIF-IADATCreERT2 und Kontrollmäuse, welche mit MPTP zwei Wochen nach Aktivierung des Ablationssystems behandelt wurden, gezeigt, dass zur Kompensation von oxidativem Stress ein intakter Nukleolus notwendig ist. Des Weiteren ergab die Analyse von Gewebe von Parkinsonpatienten eine deutlich geringere Anzahl an intakten Nukleoli in dopaminergen Neuronen im direkten Vergleich mit Kontrollgewebe. Die Ergebnisse, welche hier präsentiert werden, zeigen die Bedeutung nukleolärer Aktivität bei der oxidativen Stress-Antwort in dopaminergen Neuronen, beschreiben eine Interaktion zwischen dem Nukleolus und dem Mitochondrium und liefern neue Mausmodelle bzw. Denkansätze für die Erforschung und das Verständnis der Parkinsonschen Erkrankung.

Translation of abstract (English)

The most prominent neurodegenerative disorder associated with dopaminergic cell loss is Parkinson’s disease (PD). The main hallmark of PD is the progressive loss of substantia nigra neurons. The neuronal loss results in severe dopamine depletion in the striatum, responsible for the motor symptoms associated with PD, especially tremor, rigidity and bradykinesia. Although the pathological changes that characterize the disease are well documented, the mechanism responsible for the death of dopaminergic neurons remains to be unraveled. However, studies showed that oxidative stress is of major importance in the etiology of the disease. In order to efficiently respond to hazardous conditions, cellular stress sensors are required, like the nucleolus, which responds to cellular stress by stabilizing the transcription factor p53. Therefore, the aim of the present study was the analysis of the importance of the nucleolar function in the oxidative stress response in dopaminergic neurons and its implications in the etiology of PD. The main function of the nucleolus, a sub-organelle of the cell nucleus, is the production and assembly of ribosome components. Nucleoli are made of protein and ribosomal DNA (rDNA) sequences of chromosomes, which serves as the template for transcription of the ribosomal RNA (rRNA) for inclusion in new ribosomes. Following increased oxidative stress in dopaminergic neurons by 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) treatment, impairment of nucleolar structure and reduced nucleolar activity (RNA polymerase I) was discernible. The key player in the regulation of rDNA transcription is the transcription initiation factor IA (TIF-IA), which is responsible for the adjustment of cell biosynthetic activities to environmental conditions. In order to elucidate the role of the nucleolus within dopaminergic neurons, the Cre/loxP recombination system was used to generate mouse mutants, in which the function of the nucleolus was artificially disrupted by the ablation of TIF-IA in dopaminergic neurons (TIF-IADATCre). The impairment of nucleolar function leads to progressive loss of dopaminergic neurons, reduction of the striatal dopamine content and severely impaired locomotor performance, closely mimicking the symptoms in PD. Remarkably, nucleolar disruption causes mitochondrial impairment before structural changes in dopaminergic neurons or their projections to the striatum were observed. To assess in more detail how nucleolar disruption affects mitochondrial function, mutant mice expressing an inducible Cre recombinase have been generated, allowing the spatio-temporal control of the Cre-mediated TIF-IA ablation. By means of Cre reporter mice reliable expression of the Cre recombinase was ensured specifically in dopaminergic neurons and very low background activity of the transgene in absence of the ligand was detected. Activation of the Cre-mediated TIF-IA ablation in 2 months old animals (TIF-IADATCreERT2) leads to perturbation of nucleolar function followed by upregulation of p53, accompanied with mitochondrial dysfunction, leading to increased oxidative stress and finally to progressive loss of dopaminergic neurons. Treatment of TIF-IADATCreERT2 and control mice with MPTP showed that an intact nucleolus is crucial for the balancing of the oxidative insult. The study was complemented by the analysis of PD samples in which increased nucleolar disruption could be observed. The results show the importance of nucleolar activity in the oxidative stress response in dopaminergic neurons, reveal a relationship between nucleolar and mitochondrial function, providing a new animal model for PD research and offer a new perspective on the neurodegenerative process of PD.