English Title: In Vitro Selection of Ribozymes with Proteolytic Activity

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Abstract

Ribonukleinsäuren (RNA) gehören zu den faszinierendsten und spannendsten Biopolymeren der aktuellen Forschung. Ihre mannigfaltigen Funktionen sind für eine Vielzahl von biochemischen Prozessen von essentieller Bedeutung. Zu den bekanntesten Aufgaben der RNA gehört die Umsetzung genetischer Information in Proteine. Dabei ist RNA neben der Eigenschaft als Informationsträger auch aktiver Katalysator für die Knüpfung der Peptidbindung im Ribosom. Die funktionelle Vielfältigkeit von RNA wurde in den letzten Jahren durch die Erforschung der Genregulation mittels RNA-Interferenz bedeutend erweitert; deren Beteiligung an verschiedenen zellulären Mechanismen und Krankheiten wird aktuell intensiv erforscht. Die Entdeckung katalytisch aktiver RNA Sequenzen, so genannter Ribozyme, war ein weiterer Meilenstein in der Erforschung des multifunktionellen Potentials von RNA. Das zunächst durch die Natur eingeschränkte Katalysespektrum von Reaktionen an Phosphodiestern konnte durch die Anwendung der in vitro Selektion oder SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)und die dadurch mögliche Entdeckung neuer künstlicher Ribozyme um ein Vielfaches erweitert werden. Diese Erkenntnisse über die vielfältigen Funktionen von Ribonukleinsäuren stützen die Hypothese einer RNA-Welt, wobei das entsprechende Ribozym für jede hierfür essentielle Reaktion noch nicht gefunden werden konnte. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Erweiterung des Repertoires katalytisch aktiver RNA-Spezies durch die Selektion von Ribozymen mit proteolytischer Aktivität. Aufgrund der hohen Stabilität der Peptidbindung stellte dies eine besondere Herausforderung dar. Um das Repertoire an funktionellen Gruppen, die der RNA zur Verfügung stehen, zu erweitern und eine Peptidspaltung in Analogie zu Serinproteasen zu ermöglichen, wurde ein neuartiger Cofaktor entwickelt und hergestellt, der zwei unterschiedliche funktionelle Einheiten miteinander verbindet. Zum einen wurde eine katalytische Triade integriert, deren Aminosäuren Serin, Histidin und Aspartat durch kurze Linker miteinander verbunden sind. Zum anderen ermöglicht eine kurze PNA- (Peptide Nucleic Acid) Sequenz eine Verankerung der Triade an der RNA-Bibliothek und bringt dadurch Cofaktor und Katalysator in räumliche Nähe zueinander. Zur Realisierung dieses Projekts wurde der verbesserte Ansatz der direkten in vitro Selektion mit linkergekoppelten Substraten gewählt und hierfür ein geeignetes Selektionsschema konzipiert. Die einzelnen Selektionsschritte konnten durch Vorversuche etabliert werden. Dies beinhaltete zunächst die Synthese multifunktioneller Peptidsubstrate, die neben zwei unterschiedlichen Affinitätsmarkern auch inerte Linker und eine geeignete funktionelle Gruppe für die kovalente Verknüpfung mit der RNA-Bibliothek enthielten. Als nächster Schritt erfolgte die Optimierung der Konjugation von Peptidsubstrat und RNABibliothek. Hierfür wurde ein Protokoll gewählt, das mit RNA-Molekülen, die durch in vitro Transkription gewonnen werden, kompatibel ist und in dieser Arbeit durch die Anwendung eines neu synthetisierten Initiatornukleotids realisiert wurde. Die auf diese Weise generierte Bibliothek von RNA-Peptid-Konjugaten diente als Ausgangspunkt eines jeden Selektionszyklus, der nach Transkription und Konjugation durch eine doppelte Immobilisierung, zunächst der inaktiven und anschließend der aktiven Sequenzen, sowie der spezifischen Anreicherung aktiver Moleküle durch Reverse Transkription und Polymerase-Kettenreaktion komplettiert wurde. Eine erste durchgeführte Testselektion über 10 Runden und anschließende Analytik des minimal angereicherten RNA-Pools ermöglichten eine Konkretisierung potentieller Fehlerquellen, sowie die weitere Optimierung der einzelnen Selektionsschritte. Das in dieser Arbeit etablierte Selektionsschema bietet nun eine exzellente Ausgangsposition für die Durchführung einer in vitro Selektion für die Generierung von Ribozymen mit Proteaseaktivität.

Translation of abstract (English)

Ribonucleic acids (RNAs) are among the most fascinating biopolymers of the current research. Their diverse functions are responsible for a variety of essential biochemical processes. The most prominent task of RNA is the expression of genetic information into proteins, with RNA acting both as information carrier and as catalyst, enableing the formation of peptide bonds in the ribosome. Over the past years the functional diversity of RNA was importantly extended by the discovery of gene regulation by RNA interference, whose participation in cellular mechanism and diseases is currently intensively investigated. The discovery of catalytic active RNA sequences, the socalled ribozymes, was a further milestone in the investigation of RNA’s multifunctional capability. The limited spectrum of natural ribozymes, catalyzing basically only reactions on phosphodiester bonds, was enlarged by the application of in vitro selection or SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment), which enabled the discovery of new, artificial ribozymes of diverse functions. All these findings about the versatile functions of ribonucleic acids support the hypothesis of a RNA world, although ribozymes have not yet been found for all essential reactions. The aim of this thesis was to expand the repertoire of catalytically active RNA species by selecting a ribozyme with proteolytic activity. Due to the high stability of the peptide bond, the in vitro selection of such ribozymes appears to be a demanding task. To enlarge the variety of functional groups that are naturally available in RNA and to enable a peptide bond cleavage in analogy of serine proteases, a novel cofactor was designed and synthesized. This cofactor combines two different functional units: a catalytic triad consisting of the amino acids serine, histidine and aspartic acid, connected to each other by short linkers, and a short PNA (peptide nucleic acid) sequence, that enables the anchoring of the triad by hybridisation with the RNA pool. In this way the cofactor and the catalyst are held in close proximity to each other. To realize this project, the improved approach of direct in vitro selection with linkercoupled substrates was chosen and a novel selection scheme developed. The single steps of the selection procedure were established by preliminary tests. This includes initially the synthesis of multi-functional peptide substrates, containing two different affinity tags, inert linkers and a versatile functional group for the covalent coupling with the RNA pool. In the next step the conjugation of the peptide substrate with the RNA pool was optimized. For this purpose a protocol was chosen that is compatible with the in vitro transcribed RNA molecules and uses a novel aldehyde-carrying initiator nucleotide. The library of the RNA-peptide conjugates generated in this way constitutes the starting point for each selection cycle. Each round is completed, after transcription and conjugation, by a double immobilization strategy, first of the inactive and afterwards of the active sequences, and the specific amplification of active molecules by reverse transcription and polymerase chain reaction. The test selection (over 10 rounds) carried out in this work and the subsequent analysis of the slightly enriched RNA pool allowed the detection of potential error sources and led to an immediate optimization of the single selection steps. The selection scheme established in this work provides an excellent starting point for achieving an in vitro selection generating ribozymes with proteolytic activity.