English Title: Fluorescent quenched probes for diagnostic and analytic applications

Preview

PDF, German Download (3MB) | Terms of use

Abstract

Ziel der hier vorliegenden Arbeit war die Entwicklung fluoreszenzgelöschter Sonden, welche auf der Fluoreszenzlöschung durch photoinduzierten Elektronentransfer basieren. Es wurden zwei molekulare Sonden weiterentwickelt, die durch Guanin gelöscht werden. Einerseits wurden (i) SMART PROBES zur schnellen und spezifischen Identifizierung verschiedener Mykobakterienspezies eingesetzt. Darüber hinaus konnten (ii) SNAP-TAGS zur selektiven Markierung von Proteinen in Säugerzellen und Bakterien angewendet werden. Die der Arbeit zugrunde liegende Idee war es, eine gesteigerte Sensitivität dieser Methoden durch gezielte Fluoreszenzlöschung und damit einhergehend eine Reduzierung von unspezifischer Hintergrundfluoreszenz zu erreichen. Die spezies-spezifische, sensitive, zuverlässige und kostengünstige Identifizierung bestimmter DNA-Sequenzen als Instrument der Diagnostik bakterieller Erreger ist aufgrund unterschiedlicher Behandlungsstrategien sowie des stetigen Auftretens neuartiger Erreger von großer Bedeutung für die Routinediagnostik. Eine besondere Herausforderung stellt hierbei das Genus Mycobacterium mit seinen aktuell mehr als 100 valide beschriebenen Arten dar. Die Identifizierung sowie die exakte Differenzierung dieser Erreger sind vor allem aufgrund des zumeist sehr langsamen Wachstums der Mykobakterien von zwölf bis 20 Stunden erschwert. Ein schnelles und kostengünstiges Verfahren ist daher dringend erforderlich. Traditionelle, auf biochemischen Merkmalen gründende Identifikationssysteme werden dabei in den letzten Jahren immer mehr von molekularbiologischen Verfahren abgelöst. Eines dieser neuen Verfahren basiert auf dem Einsatz von SMART PROBES. Sie können in einem neuen, hochempfindlichen DNA-Nachweisverfahren zur Früherkennung antibiotikaresistenter Erreger eingesetzt werden. SMART PROBES sind DNA-Haarnadelsonden, welche durch konformative Änderung der Struktur entweder im fluoreszenzgelöschten oder im fluoreszierenden Zustand vorliegen. Diese Sonden wurden am Physikalisch-Chemischen Institut der Universität Heidelberg entwickelt. Die räumliche Nähe des Farbstoffs zu mehreren Guanosin-Nukleobasen in der Stamm-Schleife-Struktur führt zu einer Löschung des Fluorophors. Bei Zugabe von Gegensequenz öffnet sich die SMART PROBE, was eine lokale Trennung von Farbstoff und Guanosin bewirkt, woraus ein messbarer Fluoreszenzanstieg resultiert. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit SNAP-TAGS. Diese stellen eine neue Methode zum kovalenten Markieren von Fusionsproteinen mit synthetischen Farbstoffen sowohl für in vitro wie auch für Anwendungen in lebenden Zellen dar. Herkömmliche Methoden zur Fluoreszenzmarkierung von Proteinen greifen auf reaktive Farbstoffe oder autofluoreszierende Proteine zurück. Diese Methoden sind jedoch beschränkt durch die fehlende Selektivität beziehungsweise durch die Größe (Green Fluorescent Protein (GFP) ~ 27 kDa) der fluoreszierenden Proteine, welche oftmals der Größe des zu untersuchenden Proteins entsprechen. Des Weiteren weisen autofluoreszierende Proteine oft eine komplizierte Photophysik sowie eine geringe Photostabilität auf. Invasive Methoden, welche organische Fluorophore durch Elektroporation, Mikroinjektion oder Endozytose in die Zelle schleusen, schädigen die Zelle, wodurch ihre Funktionalität oft nicht mehr gewährleistet ist. Die SNAP-TAG Markierung bietet hier eine nicht invasive Alternative. Sie basiert auf dem irreversiblen Transfer der Benzylgruppe von O6-Benzylguanin (O6-BG) auf das DNA-Reparaturprotein O6-Alkylguanin-DNA Alkyltransferase (AGT). Dieses Protein besitzt spezifische Aktivität für O6-BG-Derivate, die zum kovalenten Markieren von AGT-Fusionsproteinen in vitro und in lebenden Zellen eingesetzt werden. Um das Potenzial der AGT-Markierung zu testen, wurden in dieser Arbeit 30 BG-Farbstoffsubstrate synthetisiert, welche den gesamten sichtbaren Wellenlängenbereich abdeckten. Die BG-Substrate wurden zunächst hinsichtlich ihre photophysikalischen Eigenschaften, Lebensdauer und relativen Quantenausbeute untersucht. Hierbei konnten neun fluoreszenzgelöschte Substrate ermittelt werden, welche den Wellenlängenbereich von 425 nm bis 700 nm abdecken. Um den Fluoreszenzanstieg nach der Markierung von AGT zu ermitteln, wurden die Substrate mit isoliertem hAGT in in vitro Experimenten eingesetzt. Für die Anwendung der AGT-Markierung in lebenden Zellen wurden zum einen AGT-Fusionsprotein exprimierende Escheria coli eingesetzt, zum anderen AGT-defiziente CHO-Zellen (Chinesische Hamster Ovarien), welche mit Expressionsvektoren transfiziert waren, die das Gen eines AGT-Fusionsproteins enthielten. Bei letzteren war das Fusionsprotein im Nukleus lokalisiert.

Translation of abstract (English)

This goal of the thesis was the development of fluorescent quenched probes based on fluorescent quenching using photo-induced electron transfer. Two molecular probes quenched by guanine were further developed. On the one hand (i) SMART PROBES were used for the fast and specific identification of different mycobacterial species. Beyond that (ii) SNAP-TAGS could be used for the selective labeling of proteins in mammalian cells and bacteria. It was the initial intention of this work to achieve an increased sensitivity of these methods by purposeful fluorescence quenching accompanied by a reduction of nonspecific background fluorescence. Due to different treatment strategies as well as the constant occurrence of new pathogenes the species-specific, sensitive, reliable and economical identification of certain DNA sequences as instrument of the diagnostics of bacterial pathogenes is of great importance in routine diagnostics. Here a special challenge to the researcher is posed by the genus mycobacterium with currently more than 100 recognized forms. Due to the in most instances very slow growth of the mycobacterias from twelve up to 20 hours the identification as well as the exact differentiation of these pathogenes are particularly difficult. Therefore, a fast and economical procedure is urgently needed. This is why recently traditional identificational systems based on biochemical characteristics are increasingly being replaced by molecular-biological procedures. One of these new procedures is based on the application of SMART PROBES. They can be used in a new, highly sensitive DNA-assay for the early recognition of antibiotic-resistant pathogenes. SMART PROBES are hairpin shaped probes, which can change the fluorescence from quenched to not quenched due to conformative change of structure. These probes were developed at the Institute of Physical Chemistry of the University of Heidelberg. The dye’s spatial proximity to several guanosine nucleobases in the stem-loop structure leads to a quenching of the fluorophore. After the addition of target sequence the SMART PROBE opens the structure, which causes a local separation from dye and guanosine, resulting in a measurable rise in fluorescence intensity. The second part of the work dealt with SNAP-TAGS. These represent a new method for covalent labeling of fusion proteins with synthetic dyes both for in vitro as well as for applications in living cells. Conventional methods for the fluorescent labeling of proteins fall back to reactive dyes or autofluorescent proteins. These methods are, however, limited by the missing selectivity and by the size of the fluorescent proteins (green fluorescent protein (GFP) ~ 27 kDa), which often correspond to the size of the protein that can be examined. Furthermore autofluorescent proteins often show a complicated photophysics as well as a small photostability. Invasive methods, which channel organic fluorophores through electroporation, micro-injection or endozytoses into the cell, damage the cell, whereby its functionality often is no longer ensured. Here SNAP-TAG labeling offers a non invasive alternative. It is based on the irreversible transfer of the benzyle group of O6-Benzylguanin (O6-BG) on the DNA repair protein O6-alkylguanine-DNA alkyltransferase (AGT). This protein possesses specific activity for O6-BG-derivates, which are inserted for covalent labeling of AGT fusion proteins in vitro as well as into living cells. In order to test the potential of the AGT labeling in this study, 30 BG-dye-substrates were synthesized covering the entire visible spectra. First the BG-substrates were examined regarding their photophysical characteristics, their lifetime and their relative quantum yield. Here nine fluorescence quenched substrates could be determined, which cover the wavelength from 425 nm to 700 nm. In order to determine the fluorescence increase after the labeling of AGT, the substrates were used with isolated hAGT in in vitro experiments. For the AGT labeling in living cells, Escheria coli were used to express AGT fusion protein, however, AGT-deficient Chinese Hamsters Ovary Cells transfected with expression vectors containing the gene of an AGT fusion protein were also employed. In the latter the fusion protein was located in the nucleus.