German Title: Entwicklung einer Methode zur Erstellung genomweiter Expressionsprofile aus kleinen Gewebeproben und deren Anwendung im Mammakarzinom: Genaktivitäts-Muster zur Entdeckung Molekularer Signalwege und zur Prädiktion des klinischen Ansprechens

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Abstract

In this thesis, a novel procedure for linear amplification of messenger RNA (mRNA) molecules and labeling with fluorescently modified nucleotides was developed, that can be used to perform genome-wide expression analysis from minute tissue samples using microarrays of long gene-specific oligonucleotide DNA probes. The procedure was then applied to analyze core needle biopsies taken at time of diagnosis from tumors of female primary breast carcinoma patients. Upon receiving chemotherapy consisting of gemcitabine, epirubicin and docetaxel, the patients were classified according to their response to the chemotherapy into responders, defined as patients with a pathological complete remission of the tumor, and non-responders, defined as patients with no change or pathological partial remission. The gene expression profiles of the tumors from these patients were then bioinformatically processed and analyzed to identify a gene expression signature, which could be used to predict the response of the patients. Additionally, this gene signature was inspected for the significantly enriched pathways and biological processes, and a subset of genes was analyzed in the patient's biopsies with respect to RNA expression as validated by real-time quantitative polymerase chain reaction and protein expression as measured by immuno-histochemistry. The gene expression signature contained 512 genes, which allow a prediction of the patient response with an overall accuracy of 88%, a sensitivity of 78% and a specificity of 90%. Signaling pathways and biological processes identified with significant enrichment in the gene set were the Ras pathway, TGF β signaling, DNA damage response and apoptosis. From these pathways, the genes DAPK2, BAMBI, LMO4 and SMAD3 could be validated by RQ-PCR, but not SRC. In protein analysis by IHC, BAMBI was strongly associated with the patient's outcome, while BMP4, LMO4, SMAD3 and SRC were not directly associated. Additionally, BAMBI protein expression showed strong relationship with BRCA1 expression in the primary female breast carcinoma. Taken together, these results show the applicability of the novel developed procedure for amplification and labeling of mRNA for genome-wide gene expression analysis with the long oligonucleotide microarray technique and the successful use in biological and clinical investigations. The analysis of gene expression profiles of the primary breast tumors revealed an association of the Ras pathway, TGF β signaling, DNA damage response and apoptosis with the outcome of the patients after chemotherapy, as well as associations of several genes within these pathways and biological processes.

Translation of abstract (German)

In der vorliegenden Dissertation wurde eine neue Methode zur Amplifikation von Boten-RNS und der Markierung mit fluoreszierenden Nukleotiden entwickelt, die sich zur Erstellung von Genexpressions-Profilen aus sehr kleinen Gewebeproben mit Hilfe genspezifischer Proben aus langen DNS-Oligonukleotiden auf Microarrays eignet. Nachfolgend wurde diese Methode angewendet, um Feinnadel-Biopsien aus Mamma-Karzinomen zu untersuchen, die den Patientinnen bei Diagnose entnommen worden waren. Nachdem die Patientinnen eine Kombinations-Chemotherapie aus Gemcitabin, Epirubicin und Docetaxel erhalten hatten, wurden sie je nach Ansprechen in "Responder", definiert als Patientinnen mit pathologisch gesicherter kompletter Remission, oder "Non-Responder", definiert als Patientinnen ohne Veränderung oder mit partialem Rückgang des Tumors, klassifiziert. Die Genexpressions-Profile dieser Tumoren wurden mit Hilfe bioinformatischer Methoden verarbeitet und analysiert, um eine Gensignatur zu identifzieren, die eine Vorhersage des Therapieansprechens erlaubt. Zusätzlich wurde diese Gensignatur auf signifikant überrepräsentierte Signalwege und biologische Prozesse hin untersucht. Ein Teil der Signaturgene wurde in den Biopsien der Patientinnen bezüglich der RNS- und Protein-Expression mit Hilfe von quantitativer Echtzeit-PCR bzw. immunhistochemischer Färbungen analysiert. Die ermittelte Genexpressions-Signatur enthält 512 Gene, und ermöglicht die Vorhersage des Therapieansprechens mit einer Gesamtgenauigkeit von 88%, einer Sensitivität von 78% und einer Spezifität von 90%. Als für das Ansprechen relevante Signalwege und biologische Prozesse wurden der Ras-Signalweg, die TGF-β-Kaskade, Antwortprozesse bei DNS-Schädigungen sowie der Apoptosemechanismus identifiziert. Aus diesen Signalwegen konnten die Gene DAPK2, BAMBI, LMO4 und SMAD3 durch qEZ-PCR validiert werden, nicht jedoch die Expression von SRC. Die Proteinanalyse zeigte eine starke Assoziation von BAMBI mit dem Therapieansprechen, während BMP4, LMO4, SMAD3 sowie SRC nicht direkt assoziiert waren. Zudem wurde ein starker Zusammenhang zwischen der Proteinexpression von BAMBI und BRCA1 in den primären Brusttumoren festgestellt. Zusammengefaßt zeigen die Ergebnisse die Einsetzbarkeit der neu ent-wickelten Methode zur Amplifikation und Markierung von Boten-RNS für die genomweite Expressionanalyse mit der verwendeten Microarray-Technik, sowie die erfolgreiche Anwendung der Methode zur Untersuchung biologischer und klinischer Fragestellungen. Die Analyse der Genexpressions-Profile der Primär-tumoren von Brustkrebspatientinnen zeigte Assoziationen des Ras-Signalwegs, der TGF-β-Kaskade, der Antwortprozesse bei DNS-Schädigungen sowie des Apoptosemechanismus mit dem Ansprechen der Patientinnen auf die Chemotherapie. Zudem wurden Abhängigkeiten zwischen diesen Signalwegen und biologischen Prozessen anhand verschiedener Gene nachgewiesen.