German Title: CryoSTED Mikroskopie - ein neuer spektroskopischer Zugang zum Verbessern der Auflösung in der STED Mikroskopie bei tiefen Temperaturen

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Abstract

This work presents a new approach for the further improving of the resolution in the sub-diffraction fluorescence STED microscopy. The reduction of the sample temperature down to 76K eliminates the disadvantages of anti-Stokes fluorescence excitation and allows the use of wavelengths with larger STED efficiencies. On the studied dyes, this approach enhances the resolving power by a factor of 1.6 compared to room temperature and suggests further technical improvements for such resolution increase. Besides resolution, the present work solves the issue of the high triplet population in fluorescence imaging at liquid nitrogen temperature. A technique for the triplet depopulation has been developed. It provides a manifold brightness increase in the fluorescence imaging at low temperatures. The utilization of the low temperature also increases the photo-stability of the fluorescent markers. The combination of a complete triplet depopulation and higher fatigue resistance allows an enhanced signal to noise ratio in STED and fluorescence microscopy in general.

Translation of abstract (German)

Diese Arbeit präsentiert einen neuen spektroskopischen Ansatz, um die Auflösungserhöhung in der hochauflösenden STED Fluoreszenzmikroskopie weiter zu verbessern. Die Reduzierung der Temperatur bis zu 76K erlaubt den Einsatz von STED Wellenlängen mit höheren Wirkungsquerschnitten für die stimulierte Emission. Es wird gezeigt, dass deren Einsatz zu einer relativen Auflösungserhöhung von 1,6 im Vergleich zu den bei Raumtemperatur einsetzbaren Wellenlängen führt. Allerdings bedingt das Arbeiten bei tiefen Temperaturen eine deutlich höhere Tripletbevölkerung und somit eine Verschlechterung des Signal-zu-Rausch Verhältnisses in der fluoreszenzbasierten Bildgebung allgemein. Dies kann durch ein in dieser Arbeit entwickeltes Verfahren zur Entvölkerung des Tripletzustands vermieden werden. Zudem ist die Photozerstörung der fluoreszenten Moleküle ebenfalls stark reduziert bei tiefen Temperaturen. Sowohl die lichtgetriebene Tripletentvölkerung als auch die hohe Photostabilität bei tiefen Temperaturen verbessern das Signal-zu-Rausch Verhältnis in der STED und Fluoreszenzmikroskopie.