German Title: Regulierung der Shh Gene Expression in der Zebrafisch Retina

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Abstract

Sonic hedgehog (Shh) a vertebrate homolog of the Drosophila melanogaster gene hedgehog, is a secreted protein that controls numerous differentiation processes during vertebrate development. In the vertebrate retina, Shh controls neurogenesis and its expression spreads in a wave like manner. The shh locus has been well characterised in vertebrates and the regulatory regions driving the expression in the notochord and the midline of the CNS were identified. In zebrafish, shh transgenes were established that drive GFP reporter expression very similar to that of the endogenous shh gene in the central nervous system including the retina. The cis-regulation behind shh expression in the retina was not known. This prompted me to map the region responsible for retina expression. I found it to be distinct from the previously described enhancers controlling expression in the midline of the neural tube and in the notochord. This novel regulatory region mediates expression of a GFP reporter cassette in the ganglion cell layer (GCL) and inner nuclear layer (INL) of the retina. The expression is initiated in a ventronasal patch and later spreads across the GCL and INL in a wave like pattern. A deletion approach identified a 300 bp region to be sufficient and necessary for driving expression in the retina. By a second series of mutations across this region using a linker scanning approach, a minimal 40 bp core important for expression was identified. While one clusters of point mutation impaired expression in both GCL and INL, another region was mapped that affected expression exclusively in the GCL. Thus, expression in the two layers can be separated. Pea3 and Erm factors were predicted to bind to the retinal enhancer. In vitro protein binding and morpholino studies prove that they are key regulatory factors responsible for driving expression in the retina. Pea3 and Erm are factors known to act downstream of Fgf signals. Earlier studies have demonstrated that Fgf signalling from the optic stalk is responsible for initiation of retinal neurogenesis. Moreover, shh was shown to be required for the spread of the shh expression wave in an auto-regulatory manner. Pharmacological inhibition and morpholino studies were performed to study the the role of Fgfs and Shh in the propagation of the expression. My results suggest that several distinct Fgfs and Hedgehogs act sequentially at several levels and that the propagation of the expression wave is dependent on a co-operation between FGF and Shh signalling pathways. This is reminiscent to the spread of the expression of the Drosophila hedgehog gene through the eye imaginal disc.

Translation of abstract (German)

Sonic hedgehog (Shh) ist ein Wirbeltier-Homolog des Drosophila melanogaster Gens Hedgehog. Es ist ein sekretiertes Protein, das zahlreiche Differenzierungsprozesse während der Wirbeltierentwicklung kontrolliert. In der Retina von Wirbeltieren kontrolliert Shh die Neurogenese und seine Expression breitet sich in wellenähnlicher Art aus. Der Shh Lokus wurde in Wirbeltieren ausführlich beschrieben und die regulatorischen Elemente, die die Expression in der Chorda und der ventralen Mittellinie des ZNS steuern, wurden identifiziert. Im Modelorganismus Zebrafisch wurden transgene Tiere erzeugt, die Reporter-GFP in einem Muster exprimieren, das dem des endogenen Shh im Zentralnervensystem sehr ähnlich ist, inklusive der Retina. Dieses Cis-regulatorische Element des Shh Locus war bis dahin nicht bekannt. Dies veranlasste mich dazu, die Region, die für die Expression in der Retina verantwortlich ist, zu kartieren. Ich fand heraus, dass sie sich von zuvor beschriebenen Enhancern unterscheidet, welche die Expression in der Mittellinie des Neuralrohrs und in der Chorda kontrollieren. Diese neue regulatorische Region vermittelt die Expression einer GFP-Reporterkassette in der Ganglienschicht (GCL) und der inneren nuklearen Schicht (INL) der Retina. Die Expression wird in einem ventronasalen Fleck initiiert und breitet sich später wellenartig über die GCL und die INL aus. Durch Deletionen konnte eine 300 bp lange Region identifiziert werden, die hinreichend und notwendig ist, um die Expression in der Retina zu steuern. Eine zweite Serie von Mutationen in dieser Region mittels der „linker scanning“ Methode führte zur Identifizierung einer minimalen 40 bp Kernsequenz, die wichtig für die Expression ist. Eine Anhäufung (Cluster) von Punktmutationen beeinträchtigte die Expression sowohl in der GCL als auch in der INL und es konnte eine weitere Region kartiert werden, die die Expression ausschließlich in der GCL beeinflusste. Somit kann die Expression in diesen zwei Schichten aufgetrennt werden. Es wurde vorhergesagt, dass Pea3/Erm Faktoren an den retinalen Enhancer binden. In vitro Proteinbindungsexperimente und Morpholino-Injektionen bewiesen, dass sie Schlüsselfaktoren für die Regulation der Expression in der Retina sind. Es ist bekannt, dass Pea3 und Erm stromabwärts von FGF Signalen wirken. Frühere Studien zeigten, dass FGF Signale vom Augenstiel verantwortlich für die Initiation der retinalen Neurogenese sind. Weiterhin wurde gezeigt, dass Shh auf autoregulatorische Weise für die Ausbreitung der Shh Expressionswelle notwendig ist. Es wurden pharmazeutische Hemmung und Morpholino-Studien angewendet, um die Rolle von FGFs und Shh in der Ausbreitung der Expression zu untersuchen. Meine Ergebnisse lassen darauf schließen, dass mehrere verschiedene FGFs und Hedgehogs aufeinanderfolgend auf mehreren Stufen wirken und dass die Ausbreitung der Expressionswelle abhängig von der Kooperation zwischen FGF- und Shh-Signalwegen ist. Dies erinnert an die Ausbreitung der Expression des Drosophila Hedgehog Gens über die Imaginalscheibe des Auges.