German Title: Pex14p und seine Liganden, strukturelle Basis der frühen Schritte des peroxisomalen Proteinimports

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Abstract

Peroxisomaler Proteinimport erfolgt mit Hilfe einer speziellen Translokalisations-Machinerie an der peroxisomalen Membran. Obwohl die beteiligten Proteine während der letzten Jahre identifiziert wurden, sind Details zum Mechanismus der Translokalisation noch nicht bekannt. Aktuelle Ergebnisse lassen auf ein „cycling receptor“ Model schließen, welches aus „cargo recognition“ (der Aufnahme von peroxisomalen Matrixproteinen im Cytosol), dem „docking“, der Abgabe der aufgenommen Proteine ins peroxisomalen Lumen und dem Rezeptor Recycling besteht. Das membranassozierte Peroxin Pex14p wird im Allgemeinen als eine Hauptkomponente des peroxisomalen „Docking“-Komplexes angesehen. Es interagiert neben einigen membrangebundenen Peroxinen mit den PTS-Rezeptoren Pex5p und Pex7p und besteht aus drei Domänen: einem konservierten N-terminus, einer hydrophoben Region und einer coiled-coil Domäne. Die N-terminale Domäne erkennt sogenannte WxxxF/Y-Motive, konservierte aromatische Sequenzen im PTS1-Rezeptor Pex5p. Obwohl es kein klassisches WxxxF/Y Motiv aufweist bindet Pex19p, ein Protein mit einer Schlüsselfunktion in der peroxisomalen Biogenese, dieselbe N-terminale Domäne von Pex14p wie Pex5p. In der vorliegenden Arbeit wurden funktionelle und strukturelle Studien am N-terminalen Tel von Pex14p durchgeführt. Die erhaltenen 3-dimensionalen Modelle beschreiben ein 3-Helix Bündel, das eine hydrophobe Interaktionsfläche für amphipatische, helikale Liganden darstellt. Der Vergleich zwischen der Komplexstruktur von Pex14p (aa 16-80W)-Pex5p (aa 116-124) mit der von Pex14p (aa 16-80W)-Pex19p (aa 66-77) zeigt dass beide die gleich Bindestelle besetzen, wobei Pex19p eine unerwartete invertierte Orientierung aufweist. Die Strukturdaten wurden durch NMR Titrations- und ITC-Experimente ergänzt, welche die kompetitive Bindung von Pex5p und Pex19p bestätigten und Pex5p als den stärkeren Liganden charakterisieren. Die so gewonnen Ergebnisse erlauben einen Einblick in die molekularen Abläufe während der frühen Schritte des peroxisomalen Imports und implizieren Voraussetzungen die mögliche Pex14p-Interaktionspartner erfüllen sollten.

Translation of abstract (English)

Peroxisomal matrix protein import is mediated by a distinct translocation machinery at the peroxisomal membrane. Although the components involved have been identified during the last years, details of the translocation mechanism are still unknown. Current evidence favour a cycling receptor model, consisting of cytosolic cargo recognition, docking, cargo release and receptor recycling. The membrane associated peroxin Pex14p has been proposed as a main component of the peroxisomal docking complex. It interacts with the PTS receptors as well as with several membrane-bound peroxins. Pex14p consist of three major domains, e.g. a conserved N-terminus, a hydrophobic region and a coiled coil domain. The N-terminal domain recognizes a conserved aromatic motif which is part of the PTS1 receptor Pex5p and called WxxxF/Y motif (Saidowsky et al 1999). Although the peroxisomal biogenesis factor Pex19p has no classical WxxxF/Y motif, it has been described as interacting with the same N-terminal domain of Pex14p as Pex5p (Fransen et al. 2004). This work presents functional und structural studies of the N-terminus of Pex14p. The obtained 3-dimensional models describe a three-helical-bundle providing a hydrophobic interaction surface for an amphipathic, helical ligand. Comparison of the N-Pex14p-Pex5p and N-Pex14p-Pex19p complex structure shows that both ligands occupy the same binding pocket, wherein Pex19p exerts an unexpected reverse orientation. The structural data was supplemented with NMR titration and ITC data confirming the binding of Pex5p and Pex19p as competitive and characterizing Pex5p as the stronger ligand. These results provide insights into the molecular recognition mechanisms of the early steps of peroxisomal import and might implicate prerequisites for possible interaction partners of Pex14p. 6