German Title: Tetrazyklin-abhängige Genexpression in cholinergen Neuronen transgener Mäuse : ein Mausmodell zur Funktionsanalyse von Neuregulin-1 in vivo

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Abstract

The goal of this thesis was to create a mouse model permitting the analysis of neuregulin-1 (NRG1) function in the adult nervous system. NRG1 is a polypeptide growth factor, which contains an ‘epidermal growth factor like’ (EGFL) domain and serves as a ligand for the erbB receptor tyrosine kinase family. Alternative splicing of the NRG1 gene gives rise to at least 15 NRG1 isoforms, which can be grouped into type I, II and III variants. NRG1 has been traditionally viewed as a growth factor important for development. However, recent studies have suggested a continuous requirement for NRG1 signaling in the mature animal. Thus far, the study of NRG1 function in vivo has been hampered by the early embryonic or perinatal death of complete and isoform-specific null mutants. To overcome the limitations of the available mouse mutants, the tetracycline regulated gene expression system (Tet-System) was utilized in this thesis. NRG1 is expressed by virtually all cholinergic neurons, therefore the choline acetyltransferase (ChAT) gene was selected to direct the expression of the tetracycline-dependent transactivator (tTA2S) to cholinergic neurons. In order to increase the likelihood that all required regulatory elements were present, a bacterial artificial chromosome (BAC), roughly 200kb in size, containing the ChAT gene and flanking sequences was used. Homologous recombination in bacteria was used to insert the tTA2S cDNA into the ChAT gene. The resulting ChAT-tTA2S BAC construct was used for the generation of transgenic animals by oocyte injection. The ChAT-tTA2S transgenic mice were subsequently characterized by in situ hybridization and by mating them to reporter mice carrying a tTA-inducible ?-galactosidase gene. In two independent transgenic founder lines, a faithful cholinergic expression was observed. In addition, mouse lines for the tTA-inducible expression of NRG1 isoforms were generated. Their functionality was assessed by mating them to the ?-CaMKII-tTA mice, in which tTA expression is directed to principal neurons of the forebrain. One mouse line was identified that showed a tight doxycyline-dependent regulation of transgene-derived NRG1 type I mRNA expression. Through the use of ChATtTA:NRG1 type I doubly transgenic animals, it is now possible to examine the effects of increased NRG1 type I expression on synaptic function and myelination in the mature nervous system. Moreover, the ChATtTA transgenic mouse lines that have been generated are universal tools to regulate the expression of any transgene of interest in cholinergic cells.

Translation of abstract (German)

Das Ziel dieser Arbeit bestand in der Herstellung eines Mausmodels, mit dessen Hilfe die Funktion von Neuregulin-1 (NRG1) im adulten Nervensystem untersucht werden kann. NRG1 ist ein Wachstumsfaktor mit einer 'epidermal growth factor like' Domäne, der als Ligand für Tyrosinkinase-Rezeptoren der ErbB-Familie wirkt. Durch alternative RNA-Prozessierung enstehen mindestens 15 NRG1-Isoformen, welche in die Typen I, II und III unterteilt werden. Bisher wurde NRG1 primär als Wachstumsfaktor betrachtet, der eine wichtige Rolle bei der Entwicklung des Nervensystems spielt. Neuere Beobachtungen weisen jedoch darauf hin, dass auch im erwachsenen Tier ein kontinuierlicher Bedarf an NRG1 besteht. Der frühe Tod der NRG1-Mausmutanten hat allerdings Untersuchungen zur Funktion von NRG1 im postnatalen und adulten Nervensystem erschwert. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das System zur tetrazyklinabhängigen Genregulation (Tet-System) eingesetzt, um eine regulierbare adulte Überexpression von NRG1-Isoformen zu erreichen. NRG1 wird von nahezu allen cholinergen Neuronen exprimiert. Um die Expression des tetrazyklinabhängigen Transaktivators tTA2S in allen cholinergen Zellen zu gewährleisten, wurden daher regulatorische Elemente des Cholin-Azetyltransferase Gens gewählt. Für eine möglichst präzise Expressionskontrolle wurde ein etwa 200 kb großes ‚bacterial artificial chromosome’ (BAC) verwendet, welches das gesamte ChAT-Gen und flankierende Bereiche umfasst. Durch homologe Rekombination in Bakterien wurde die tTA2S-cDNA in das ChAT-Gen eingebracht und das resultierende ChAT-tTA2S BAC-Konstrukt zur Herstellung transgener Mäuse verwendet. Die Charakterisierung ChAT-tTA2S transgener Mäuse erfolgte durch in situ-Hybridisierung und Verpaarung mit Reporterlinien, die ein tTA-induzierbares ?-Galaktosidase-Gen tragen. Es wurden zwei transgene ChAT-tTA2S Linien identifiziert, die eine cholinerg-spezifische tTA-Aktivität aufweisen. Weiterhin wurden Mauslinien hergestellt, die eine tTA-abhängige Expression von NRG1-Isoformen ermöglichen sollten. Diese Mauslinien wurden durch Verpaarung mit der ?-CamMKII-tTA Mauslinie charakterisiert, die tTA in Prinzipalneuronen des Vorderhirns exprimiert. Es konnte eine Mauslinie identifiziert werden, die sich durch eine stringente, doxyzyklinabhängige Expression von NRG1 Typ I-mRNA auszeichnet. Mit Hilfe ChAT-tTA:NRG1 Typ I doppelt-transgener Mäusen wird es erstmals möglich sein, die Auswirkungen einer erhöhten NRG1 Typ I-Expression auf die Funktion von Synapsen und die Myelinisierung im adulten Nervensystem zu untersuchen. Darüber hinaus stellen ChAT-tTA transgene Mäuse ein wertvolles Werkzeug dar, mit dessen Hilfe die Funktion von Genen in cholinergen Neuronen untersucht werden kann.