English Title: Hap46, a multifunctional protein

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Abstract

Hap46 ist ein multifunktionales Protein, welches über direkte Bindungspartner oder indirekt, über hsc70 als Brückenprotein, auf zelluläre Vorgänge wie Apoptose, Transkription, Signaltransduktion und Proliferation einwirken kann. Zudem fungiert es als Co-Chaperon von hsc70. Um die vielfältigen Funktionen von Hap46 innerhalb der Zelle besser verstehen und einordnen zu können, vor allem im Hinblick darauf, daß Hap46 bei vielen Tumorarten eine veränderte Expression aufweist, wurde in der vorliegenden Arbeit die Interaktion von Hap46 mit dem Chaperon hsc70, mit DNA und mit dem Transkriptionsfaktor c-Jun näher untersucht. Auf einer hervorstehenden Protuberanz der ATPase-Domäne von hsc70 konnten für die Bindung an Hap46 wichtige Aminosäuren identifiziert werden: Glutamin22 und Lysin25. Interaktionsregionen von hsc70 auf Hap46 wurden durch Analyse membrangebundener Peptide identifiziert. Der quantitative Beitrag dieser Interaktionsregionen wurde mittels Elisa-Analysen mit gekoppeltem hsc70 und Deletionsmutanten von Hap46 überprüft. Es zeigte sich, daß außer dem C-Terminus von Hap46, welcher für die Bindung an hsc70 essentiell ist (BAG-Domäne), auch die N-terminalen ersten zehn Aminosäuren einen wesentlichen Beitrag für die Interaktion der beiden Proteine leisten. Diese N-terminalen Aminosäuren sind essentiell für die DNA-Bindung von Hap46. Mutationsanalysen des DNA-Bindungsmotivs mit anschließender Überprüfung des Bindungsverhaltens über Gel-Retardationsassays ergaben, daß die beiden mittleren Aminosäuren zweier basischer Tripletts, das Lysin3 und Arginin7, zusammen mit den jeweils benachbarten Aminosäuren eine wichtige Rolle spielen. Die Bindung von Hap46 an DNA zeigte zudem eine hohe Flexibilität, die dann zum Tragen kommt, wenn Hap46 außer mit DNA mit anderen Proteinen interagiert. So konnte ebenfalls in Gel-Retardationsassays nachgewiesen werden, daß an DNA gebundenes Hap46 immer noch mit c-Jun interagieren kann. Dies ist insofern von Bedeutung, da die DNA-Bindungsregion von Hap46 als eine wichtige Interaktionsplattform von c-Jun identifiziert wurde. Mittels Elisa-Analysen wurde gezeigt, daß sich die Affinität der Deletionsmutante Hap46?N16, bei der die ersten 16 Aminosäuren von Hap46 deletiert sind, zu c-Jun um 60% verringerte. Umgekehrt konnten über Analyse membrangebundener Peptide Interaktionsregionen von Hap46 auf c-Jun identifiziert werden. Diese umfassen die DNA-Bindungsdomäne von c-Jun, den Leuzin-Zipper und die JNK-Binderegion. Letztere Region wurde hierbei näher untersucht, wobei über Mutationsanalysen die Aminosäuren Lysin an den Positionen 32, 35, 50 und 56, und Arginin an Position 54 als für die Bindung an Hap46 notwendig identifiziert wurden. Obwohl die Bindungsregionen von Hap46 und JNK auf c-Jun identisch sind, beeinträchtigt die Bindung von Hap46 an c-Jun in vitro die Phosphorylierung durch JNK nicht. In vivo weisen jedoch vorläufige Daten darauf hin, daß Hap46 die c-Jun abhängige Transkription reprimiert.

Translation of abstract (English)

Hap46 is a multifunctional protein that contributes to many cellular processes, like apoptosis, transcription, and proliferation, by interacting either directly with other molecules or indirectly, with hsc70 as a bridging protein. In addition, it also functions as a co-chaperone for hsc70. Especially since Hap46 is known to have an altered expression in many tumors, the interaction of Hap46 with the chaperone hsc70, with DNA, and with the transcription factor c-Jun was examined in more detail to obtain a deeper understanding of the various roles of Hap46 in the processes inside a cell. On a prominent protuberance within the ATPase-domain of hsc70 amino acids were identified that are important for the interaction with Hap46: glutamin 22 and lysin 25. Furthermore, by means of analysis of membrane-bound peptides, interaction regions of hsc70 on Hap46 were identified. The quantitative contribution of these interaction regions were examined by applying the Elisa-technique with coupled hsc70 and using deletion-mutants of Hap46. It was shown that not only the C-teminal part of Hap46 (BAG-domain), that is essential for hsc70 binding, but also the N-terminal first ten amino acids have a substantial contribution to the interaction of the two proteins. These N-terminal amino acids are essential for the DNA-binding of Hap46. Mutational analyses of the DNA-binding motif with subsequent examination of the binding by gel-retardation-assays showed that the lysin 3 and the arginin7, together with their neighboring amino acids contribute strongly to the binding to DNA. Furthermore, these amino acids showa high flexibility by the interaction with DNA. This flexibility is important if Hap46 interacts simultaneously with DNA and other proteins. So it was shown, also in gel-retardation-analyses, that Hap46 bound to DNA is still able to interact with c-Jun. This in so far of relevance as the DNA-binding region of Hap46 could be identified as an important interaction platform for c-Jun. Using the Elisa-technique it was shown that the affinity for the deletion mutant Hap46?N16, a variant of Hap46 missing the first 16 amino acids, to bind to c-Jun was reduced by 60%. Vice versa, analyses of membrane bound peptides identified interaction regions of Hap46 on c-Jun. These include the DNA-binding domain of c-Jun, the Leucin-Zipper, and the JNK docking-site. Mutational analyses of the last showed that lysin at positions 32, 35, 50, and 56, and arginine, at position 54, are important for the interaction with Hap46. Although the binding regions of Hap46 and JNK on c-Jun are identical, Hap46 does not hinder the JNK-dependent phosphorylation of c-Jun in vitro. However, preliminary data suggest that Hap46 reduces c-Jun dependent transcription in vivo.