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Abstract

Das Nervensystem ist eines der komplexesten Organe und nimmt durch seine Funktionen, die beim Menschen als kognitive Leistungen zusammengefasst werden, eine besondere Stellung ein. Drei grundlegende Prozesse sind bei der Bildung des Nervensystems während der Entwicklung von entscheidender Bedeutung: Bildung von unterschiedlichen Neuronenklassen durch Zelldifferenzierung, Vernetzung der Nervenzellen durch zielgerichtetes axonales Auswachsen und Verschaltung durch Synapsenbildung. Die Mechanismen zur korrekten Vernetzung, die eine unabdingbare Voraussetzung zur Etablierung der synaptischen Verschaltungen sind, sind nur ansatzweise bekannt. Bekannte Rezeptoren (UNC-5, UNC-40/DCC, und SAX-3/Robo), die für die axonale Wegfindung wichtig sind, gehören zu den Immunglobulin-Zelladhäsionsmolekülen (IgCAMs). Durch die Analyse des vollständig sequenzierten Genoms von C.elegans konnten die Mitglieder dieser Familie identifiziert werden. C. elegans besitzt 17 IgCAMs, die entweder aus Ig-Domänen oder aus Ig-Domänen und Fibronektin III Domänen bestehen. Durch den kurzen Generationszyklus und die Möglichkeit Deletionsmutanten herzustellen, eignet sich C. elegans sehr gut zur in vivo Analyse der kompletten Genfamilie. Für vier IgCAMs (LAD-1, UNC-5, UNC-40, und SAX-3) lagen zu Beginn dieser Arbeit schon funktionelle Untersuchungen vor. Für eine erste Abschätzung der Funktion der weiteren 13 IgCAMs wurde die Expression analysiert. Diese IgCAMs zeigen im Verlauf der Entwicklung eine dynamische Expression, die meist nicht auf ein einzelnes Gewebe beschränkt ist. Nur drei IgCAMs (RIG-3, RIG-6b/d, und LAD-2) sind ausschließlich neuronal exprimiert, alle weiteren zeigen neuronale und nicht neuronale Expression. Die neuronale Expression der Mehrzahl der IgCAMs beginnt bereits zum Zeitpunkt des axonalen Auswachsens, so dass eine Rolle bei der axonalen Wegfindung möglich ist. Zur funktionellen Charakterisierung der IgCAMs wurde eine C. elegans Deletionsbank mit ca. 2 mio. mutagenisierten Genomen hergestellt und für zehn von 13 IgCAMs Deletionsmutanten isoliert. Die Deletionen führen überwiegend zu einem vorzeitigen Stopcodon, was einen Funktionsverlust zur Folge hat. In der Deletion von SYG-2 bleibt das ursprüngliche Leseraster erhalten, allerdings fehlt die Fibronektin III Domäne. Die Analyse der Mutanten erfolgte hauptsächlich mit neuronalen Markern. Sieben der zehn Deletionsmutanten zeigen leichte bis mittelschwere Defekte im Nervensystem, die aber alle nicht zu einer Beeinträchtigung der Bewegung, der Nahrungsaufnahme und allgemein der Lebensfähigkeit von C. elegans führen. Die Defekte im Nervensystem betreffen Interneuronaxone, die zwischen den beiden Axonbündeln des Ventralstranges Überkreuzungen aufweisen. Außerdem wachsen in einigen Mutanten Kommissuren der DA/DB Motorneurone auf der falschen Seite Richtung Dorsalstrang. Das kann entweder auf ein Fehlen von IgCAM vermittelten Signalen für das axonale Auswachsen zurückgeführt werden, oder aus einer verminderten Adhäsion resultieren. Die neuronalen Defekte der Deletionsmutanten zeigen, dass IgCAMs zwar bei der Etablierung des Nervensystems beteiligt sind, aber im Einzelnen nur eine lokal begrenzte Funktion aufweisen. Vor allem in vitro Studien haben gezeigt, dass IgCAMs in funktionalen Komplexen zusammenwirken, so dass man davon ausgehen kann, dass Doppel- und Mehrfachmutanten stärkere Defekte zeigen. Durch die exemplarische Analyse von Doppelmutanten der in Motorneuronen exprimierten IgCAMs, konnte auf keine Interaktion dieser IgCAMs geschlossen werden. Allerdings wurden durch solche Untersuchungen Hinweise auf eine Interaktion von rig-1 und rig-3, die beide in Interneuronen exprimiert sind, gefunden. Die Expression der IgCAMs weist auf viele weitere mögliche Funktionen innerhalb des Nervensystems z.B. bei der Synapsenbildung, genauso wie in anderen Geweben wie z.B. in Muskel und in Hypodermis, hin. Die isolierten Deletionsmutanten bilden die Basis, diese möglichen Interaktionen in Zukunft mittels Doppel- und Mehrfachmutanten zu analysieren.

Translation of abstract (English)

The nervous system is one of the most complex organs that has evolved. Its outstanding role is emphasised by its function, which culminates in the capability of cognition. Three basic steps are important for the development and correct wiring of the nervous system: initially different classes of neurons are established during cell differentiation. In a second step axons have to grow out into their target area. This is a prerequisite for the final step, namely the formation of specific synaptic contacts. The mechanisms of directed axonal outgrowth are only partially understood. Known receptor molecules like UNC-5, UNC-40/DCC and SAX-3/Robo belong to the immunoglobulin cell adhesion molecule family (IgCAMs). After the completion of sequencing and analysis of the C.elegans genome all members of this family were identified. C. elegans contains 17 IgCAMs, consisting either of Ig domains only or fibronectin III domains in addition. With a short generation cycle and the possibility to quickly generate deletion mutants, C. elegans is perfectly suited for a functional analysis of the whole IgCAM family. For four IgCAMs (LAD-1, UNC-5, UNC-40 and SAX-3) detailed analysis by other labs revealed their function in development and particularly in the nervous system. To get a first impression where the remaining 13 IgCAMs might function, their expression was examined. Transgenic animals were generated expressing promoter-GFP fusion constructs for individual IgCAMs. Expression typically is dynamic and not confined to a single tissue. Only three IgCAMs show exclusively neuronal expression, the others show predominantly expression in particular subsets of neurons as well as in non-neuronal tissue. The expression for most of them starts already during axon outgrowth, suggesting a role in axonal pathfinding. For functional characterization a library of mutagenized worms was generated consisting of 2 mio. mutagenized genomes to isolate deletion alleles. For ten out of 13 IgCAMs a deletion mutant were isolated. The majority of the deletions produce a premature stop codon, likely to cause a complete loss of function. For syg-2 only an in-frame deletion could be isolated, which takes out the fibronectin III domain. The analysis of the mutants was mainly carried out with neuronal markers. Seven out of ten mutants show weak to moderate defects in the nervous system. Defects were found in interneuron axons which cross erroneously to the contralateral axon bundle of the ventral cord and in commissures of the DA/DB motor neurons which grow out on the wrong side. All mutants are viable and healthy and show normal movement indicating that the motor circuit is functional. The observed defects are probably due to defective signal transduction or adhesion mediated by IgCAMs. These defects show that the analyzed IgCAMs do have a function in establishing the nervous system, but it is rather local and confined to certain neurons compared to UNC-5, UNC-40 or SAX-3, which act as more global guidance cues. In vitro studies have shown that IgCAMs can form functional complexes and act in combination so that double mutants and even triple mutants could have a greater impact on nervous system development. To test this double mutants of IgCAMs expressed in motor neurons were generated, but gave no evidence for interaction. By contrast different defects compared to the single mutants were discovered with rig-1/rig-3 double mutant suggesting an heterophilic interaction between these molecules. The expression of the IgCAMs indicates a variety of possible interactions within the nervous system only, between the nervous system and other tissues, as well as among non-neuronal tissues. These putative interactions can be tested by further analysis of double as well as tripe mutants. The isolated deletion alleles provide a useful basis to explore these functional interactions in the future.