English Title: Examination of Type I Interferon Signal Transduction in HPV Onkogene immortalised Keratinocytes

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Abstract

Humanes Papillomvirus (HPV)16 gehört zu der Gruppe der �high risk� Viren, die mit der Entstehung der Zervixkarzinome assoziiert werden. Im Verlauf der HPV-vermittelten Tumorigenese wird die Kommunikation infizierter Zellen mit dem Immunsystem verändert. In der vorliegenden Arbeit wird zum ersten Mal gezeigt, daß es durch HPV-Infektion zu einer Reduktion der Interferon- (IFN-) Expression kommt, wobei die IFN--Transkription unverändert bleibt. Dieser Effekt wird durch das Onkoprotein E6 von HPV16 vermittelt. Bemerkenswert ist, daß das IFN--Gen in tumorigenen Zervixkarzinom-Zelllinien weder konstitutiv exprimiert wird, noch durch IFN-induzierende Viren, wie �Newcastle-Disease-Virus� (NDV) oder Sendai-Virus (SeV), reinduziert werden kann. Dies zeigt, daß es innerhalb der HPV-vermittelten Karzinogenese zu einem kompletten Abschalten der IFN--Genexpression kommt. Der Vorteil dieses Verlustes besteht für eine Tumor-Zelle in der verminderten Kontrolle durch das Immunsystem. Die Kommunikation zwischen infiziertem Keratinozyt und immunologischen Effektorzellen wird gestört, da eine Induktion von Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α) durch IFN- in Monozyten und dendritischen Zellen ausbleibt. Mit Hilfe der Indikatorviren Encephalo-Myocarditis-Virus (EMCV) und Vesikulo-Stomatitis-Virus (VSV) konnte die biologische Aktivität der konstitutiv exprimierten Interferone gezeigt und ein Zusammenhang zwischen mangelnder IFN--Expression und Verlust der Protektion gegenüber VSV erklärt werden. Dieser gegenüber primären Keratinozyten verschlechterte antivirale Status in E6 exprimierenden Zellen geht nachweislich mit einer verminderten Expression IFN-abhängiger Gene einher, wie z.B. PKR, MxA, IRF-7 und p48 (IRF-9). Untersuchungen der IFN-Signaltransduktion zeigten, daß E6 auf die �Interferon-Regulatory-Factor� (IRF)-3-Aktivierung und Dimerisierung sowie die nachfolgende Induktion des IFN--Gens keinen negativen Einfluß ausübt. Dies steht ebenso im Gegensatz zu bisherigen Publikationen wie auch die oben genannte Beobachtung, dass das Onkoprotein E7 nicht die p48-abhängige IFN-Signaltransduktion inhibiert. Bemerkenswert ist die E6-abhängige, verminderte Induzierbarkeit von IRF-1 nach TNF-α-Behandlung. Dieser Effekt ist insofern spezifisch als die Aktivierung von NFB durch TNF-α unbeeinflusst blieb. Interessanterweise ist ein wesentliches Merkmal tumorigener Zervixkarzinom-Zelllinien die Inhibierung der TNF-α-vermittelten Induktion des IFN--Gens. Diese Hemmung der TNF-α-Signaltransduktion konnte ebenfalls der E6-Onkogenexpression zugeschrieben werden. Eine Inaktivierung dieser beiden E6-vermittelten Mechanismen, der IFN--Expression wie auch der TNF-α-vermittelten Induktion von IRF-1, scheint somit ein wesentlicher Mechanismus innerhalb der durch HPV-vermittelten Karzinogenese zu sein, der es infizierten Zellen ermöglicht, sich der wachstumsinhibierenden Kontrolle durch Interferone sowie der Kontrolle durch das Immunsystem leichter zu entziehen.

Translation of abstract (English)

Human papillomavirus (HPV) 16 is etiologically involved in the development of cervical cancer. During progression the communication between infected cells and the immune system becomes disturbed. In the present study, it is shown that HPV infection causes a significant inhibition of constitutive interferon (IFN) - expression, whereas IFN- transcription remains unchanged. This effect could be linked to the presence of the oncogene E6 of HPV16. Remarkably, in tumorigenic cervical carcinoma cell lines the IFN- gene is neither constitutively expressed nor can it be stimulated by IFN inducible viruses such as Newcastle-Disease-Virus (NDV) or Sendai-Virus (SeV). This indicates that E6 oncogene expression leads to a general down-regulation of IFN- gene expression during HPV mediated carcinogenesis. As a consequence, the communication between infected keratinocyte and immunologic effector cell is disturbed, since the induction of Tumor-Necrosis-Factor-α (TNF-α) by IFN- in monocytes and dendritic cells is lost. In immortalized HPV positive keratinocytes the biological activity of constitutively expressed interferons was confirmed in antiviral protection assays against Encephalo-Myocarditis-Virus (EMCV) infection. Inhibition of IFN- expression in E6 expressing cells could be correlated with a loss of protection against Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV). The observed impairment of the antiviral state in E6 and E6/7 cells was accompanied by a lowered expression of IFN dependent genes such as PKR, MxA, IRF-7 and p48 (IRF-9). Studies on the IFN signal transduction pathway showed that i.) E6 had no effect on dimerization of IRF-3 after virus infection and ii.) E7 does not inhibit p48 mediated IFN signal transduction. This is in contrast to previous publications where a direct binding and functional inactivation of E6 to IRF-3 as well as E7 to p48 has been postulated. Notably, TNF-α mediated induction of IRF-1 is reduced in E6 expressing cells, while the activation of NFB is not altered. A fundamental feature of cervical carcinoma cells is the loss of TNF-α mediated IFN- gene induction. This inhibition of the TNF-α induced IRF-1 activation could now also be linked to E6 oncogene expression. The E6 mediated reduction of IFN- expression as well as the abrogation of TNF-α induced IRF-1 expression seem to be key mechanisms during HPV induced carcinogenesis that enable the infected cells to escape from immunologic control as well as to evade from the growth inhibitory effects of the interferons.