English Title: Cloning, characterization, and overexpression of pyrophosphatases from Beta vulgaris L.

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Abstract

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden membranständige vakuoläre H+-Pyrophosphatasen (V-PPasen) und lösliche Pyrophosphatasen (S-PPasen) der Zuckerrübe untersucht. Nach der vorherrschenden Meinung erfolgt die Akkumulation von Saccharose in den Vakuolen des Speicherparenchyms durch einen Saccharose/H+-Antiporter unter Energetisierung des Tonoplasten durch die vakuoläre V-ATPase und/oder V-PPase. Letztere zählt neben der Pyrophosphat-abhängigen Phosphofructokinase und der UDP-Glucose-Pyrophosphorylase zu den speziellen pflanzlichen Enzymen, die Pyrophosphat (PPi) als alternative Energiequelle zu ATP verwenden können. Es wird vermutet, dass diese Enzyme vor allem unter hypoxischen Bedingungen eine wichtige Rolle spielen, indem sie ATP-unabhängige Stoffwechselwege ermöglichen. Hier wurde gezeigt, dass in der Zuckerrübe hypoxische Bedingungen herrschen: Die O2-Konzentration fiel von 12,7% (v/v) im Bereich der Rinde auf 3,4% in 2,5 cm Tiefe ab. In Northernblot-Analysen wurde aber keine Korrelation zwischen der O2-Konzentration und der Expression von V-ATPase und V-PPase gefunden. Das Vorkommen PPi-utilisierender Enzyme im Cytosol pflanzlicher Zellen hatte andere Autoren zu der Hypothese geführt, dass lösliche Pyrophosphatasen (S-PPasen) auf die Plastiden beschränkt seien. Im Rahmen dieser Arbeit wurden vier vollständige cDNA-Sequenzen von S-PPasen aus Beta vulgaris (BSP1-BSP4) kloniert. Reporterprotein-Studien, die mit der BSP1-Sequenz durchgeführt wurden, bestätigten die Vorhersage der in silico-Analyse, nach der es sich bei BSP1 um ein cytosolisches Protein handelt. Aufgrund der hohen Sequenzidentität ist diese Lokalisierung auch für BSP2 und BSP3 anzunehmen. Die Hypothese einer rein plastidären Lokalisierung pflanzlicher S-PPasen kann demnach nicht aufrechterhalten werden. Die abgeleitete Proteinsequenz von BSP4 weist hingegen ein plastidäres Transitpeptid auf und hat nur geringe Ähnlichkeit zu den drei cytosolischen Isoformen. Durch Vergleiche mit S-PPasen anderer Species wurden typische Sequenzmotive identifiziert, die die Bestimmung der subzellulären Lokalisierung von S-PPasen allein aufgrund der Primärstruktur ermöglichen. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass die cytosolischen Isoformen der Pflanzen prokaryontischen S-PPasen gleichen, während die plastidären Isoformen näher mit den S-PPasen der Pilze und Tiere verwandt sind. Die Proteine BSP1 und BSP2 wurden in E. coli überexprimiert und anschließend unter nativen Bedingungen aufgereinigt. Nachdem der Funktionsnachweis erbracht worden war, erfolgte eine umfangreiche biochemische Charakterisierung der rekombinanten Proteine, die nur in Gegenwart bestimmter zweiwertiger Kationen - präferentiell Mg2+ - Aktivität zeigten. Ca2+-Ionen hatten einen inhibitorischen Effekt. Für BSP1 und BSP2 wurden pH-Optima von 7,5 und 8,0 sowie Temperaturoptima von 53 °C bzw. 58 °C bestimmt. Die Km-Werte der beiden S-PPasen sind mit 51 und 53 µM PPi 10-20mal höher als die für V-PPasen bekannten Werte. Die Expression sowohl von löslichen als auch vakuolären Pyrophosphatasen in B. vulgaris unterliegt einer gewebe- und entwicklungsabhängigen Regulation. Die höchsten Transkriptspiegel fanden sich in Suspensionskulturzellen, jungen Blättern und Wurzeln sowie bei Rüben in der Präspeicherphase. In Source-Blättern und reifen Rüben war die Expression der V-PPase dagegen reduziert und die der S-PPase kaum nachweisbar. Diese Verteilung deutet auf eine besondere Bedeutung der Pyrophosphatasen für Wachstumsprozesse hin. Unter Berücksichtigung der unterschiedlichen Km-Werte könnte die physiologische Bedeutung der cytosolischen S-PPasen demnach darin bestehen, in metabolisch aktiven Zellen den PPi-Spiegel im Sinne eines Kompromisses auf ein Niveau zu senken, bei dem einerseits Biosyntheseprozesse ungehemmt ablaufen und andererseits Enzyme mit hoher Affinität zu PPi dieses Substrat als alternative Energiequelle zu ATP nutzen können. In einem transgenen Ansatz wurden B. vulgaris (Nutzpflanze) und A. thaliana (Modellpflanze) mit dem Ziel einer Erhöhung der proton motive force am Tonoplasten mit dem Gen für eine vakuoläre H+-Pyrophosphatase (BVP1) transformiert. Die Hypothese, dass dies zu einer verbesserten Transportleistung vakuolärer Antiportsysteme führt und sich somit Salztoleranz (bei A. thaliana) oder ein gesteigerter Saccharosegehalt (bei B. vulgaris) vermitteln lassen, kann nun experimentell geprüft werden. Um unterscheiden zu können, ob die möglicherweise veränderten Wachstumseigenschaften der Transformanten einer erhöhten Energetisierung des Tonoplasten oder aber der gesteigerten Hydrolyse von Pyrophosphat zuzuschreiben sind, wurden außerdem erstmals Transformanten hergestellt, die das Gen einer pflanzlichen S-PPase überexprimieren. Schließlich wurde ein Doppelkonstrukt kloniert, mit dem beide PPase-Typen gleichzeitig zur Überexpression gebracht werden konnten.