German Title: Vom endoplasmatischen Retikulum zum Golgiapparat : in vitro und in vivo Studien zum Verständnis der Funktion von COPII Vesikeln in Pflanzenzellen

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Abstract

The Endoplasmic Reticulum (ER) to Golgi transport is mediated by COPII vesicle in yeast and mammalian cell. COPII coats consist of the small GTPase Sar1p and the heterodimeric protein complexes Sec23/24 and Sec13/31. COPII mediated sorting occur when protein cargoes exit the ER. Although the principles of ER-to-GA transport organization in plant cells are supposed to be similar to those in yeast and mammalian systems, evidence in support of such an assertion is largely circumstantial. Moreover, there is a substantial body of evidence that emphasizes the differences, such as the apparent absence of the intermediate compartment in plants, large numbers of GA stacks moving along the ER and the differences in the organization of the cytoskeleton involved in interrelationships between the ER and GA. In this study, in vitro and in vivo approaches were employed to understand the function of the COPII vesicles in plant cells. In vitro, we have set up a budding assay which we could monitor the in vitro formation of COPII vesicle using ER-rich microsome, 30% (NH4)2SO4 cytosol GMP-PNP and ATP regenerating system. The vesicle budding was enhanced when ER-rich microsome from a Sec12 overproducer and more Sar1p are available in the budding mixture. Putative COPII vesicles were isolated from a flotation gradient at 41% sucrose fraction and observed as 50 nm in diameter vesicle under the electric microscope. The ability of the cytosolic tail of a plant p24 protein to bind COPI and COPII subunits from plant and animal sources in vitro has been examined. We have found that a dihydrophobic motif in the -7,-8 position (relative to the cytosolic carboxy-terminus) is responsible for binding of COPII subunits from both Arabidopsis and rat liver cytosol. However, unlike rat liver cytosol, COPI from plant sources has a stronger affinity for p24 cytosolic tails than COPII. Only in the absence of the dilysine motif in the -3,-4 position (which strongly cooperates with the dihydrophobic motif in the -7,-8 position in binding COPI) or after COPI depletion could we observe COPII binding to the p24 tail with plant cytosol. In order to visualize ERESs in tobacco BY-2 cells we have employed two different approaches: a) direct visualization of endogenous COPII proteins (Sar1, Sec13, Sec23) in cell lines stably expressing ER- and Golgi-localized GFP-markers by immunoflourescence microscopy, and b) visualization of ER-bound Sec13 by expression of a Sec13-GFP construct in cells transiently expressing ER- and Golgi-localized RFP markers. In both cases ERESs considerably outnumber Golgi stacks, and some ERESs colocalize with Golgi stacks. Dual wavelength live cell imaging of ERESs (Sec13-GFP) and Golgi stacks (Man1-RFP) demonstrates that, as they move, Golgi stacks collect ERESs at their periphery. ERESs do not disappear as a result of BFA treatment, despite considerable morphological changes in the Golgi apparatus. Prevention of ER-export through expression of a Sar1 mutant locked in the GDP state leads to the partial loss of visible ERESs.

Translation of abstract (German)

Der Transport zwischen ER und Golgi wird in Hefe und in Säugetierzellen durch COPII- Vesikel vermittelt. Der COPII-Proteinmantel besteht aus der kleinen GTPase Sar1p und den Heterodimerproteinkomplexen Sec23/24 und Sec13/Sec31. Das COPII vermittelte Sorting kommt zustande, wenn die Proteintransporter das ER verlassen. Obwohl die Vorgänge des ER-GA-Transports in Pflanzen ähnlich zu sein scheinen wie in Hefe- und Säugetiersystemen, ist kein Beweis vorhanden, der diese These unterstützt. Mehr noch, es gibt deutliche Hinweise, die nahe legen, dass Unterschiede im Ablauf dieser Prozesse auftreten, wie zum Beispiel das Fehlen des intermediären Kompartiments in Pflanzen, eine große Zahl von Golgiapparaten bewegen sich entlang des Endoplasmatischen Retikulums sowie die Unterschiede in Aufbau und Organisation des Cytoskelets, das an der Interaktion zwischen ER und Golgi beteiligt ist. In dieser Arbeit werden in vitro und in vivo Ergebnisse zum Verständnis der Funktion von COPII-Vesikeln in Pflanzen herangezogen. In den in vitro vorgenommenen Studien gelang es uns ein Bindungsassay zu entwickeln mit der wir die in vitro Formation von COPII-Vesikeln aufzeigen können. Hierzu wurden ER-reiche Microsomen, 30% (NH4)2SO4 Zytosol, GMP-PNP und ein ATP regenierendes System verwandt. Die Vesikelbildung wurde verstärkt, wenn ER-reiche Mikrosomen eines Sec12 Überproduzenten und zusätzliches Sar1p in der Bindungsmixtur verfügbar sind. Potentielle COPII Vesikel wurden von floatierenden Gradienten in der 41 % Saccharosefraktion isoliert, unter dem Elektronenmikroskop stellen sich diese als 50 nm große Vesikel heraus. Die Fähigkeit des cytosolischen Teils eines pflanzlichen p24 Proteins COPI und COPII- Untereinheiten aus pflanzlichen und tierischen Quellen zu binden, konnte ebenfalls in vitro nachgewiesen werden. Wir fanden ein dihydrophobes Motiv an der -7,-8 Position (relativ zum zytosolischen Carboxyterminus), der für die Bindung der COPII-Untereinheiten sowohl in Arabidobsis als auch im Zytosol von Ratten Leberzellen verantwortlich zu sein scheint. Wie auch immer, anders als im Rattenleberzytosol haben COPI Vesikel aus pflanzlicher Quelle eine stärkere Affinität zum cytosolischen Teil des p24 Proteins als COPII. Nur bei Fehlen des Dilysine-Motivs in der -3,-4 Position (die sehr stark mit dem dihydrophobischen Motiv in der -7,-8 Position interagiert) oder nach dem Entfernen von COPI konnten wir die Bindung von COPII an den p24-Schwanz mit Pflanzenzytosol nachweisen. Mit dem Hintergrund ERESs in Tabak BY2-Zellen zu visualisieren haben wir zwei verschiedene Methoden entwickelt: a) die direkte Darstellung von endogenen COPII Proteinen (Sar1, Sec13, Sec23) durch Immunfluoreszenzmikroskopie in stabilen Zellinien, die ER- und Golgi lokalisierte GFP-Markerproteine expremieren, und die Darstellung von membrangebundenem Sec13 durch Expression eines Sec13-GFP-Konstrukts in Zellen, die transient ER- und Golgi-lokalisierte RFP-Marker expremieren. In beiden Fällen begrenzen die ERESs erwartungsgemäß die Golgi-Stapel und einige ERESs sind mit Dictyosomen kolokalisiert. Dual-wavelength live cell imaging von ERESs (Sec13-GFP) und Golgi Stapeln (Man1-RFP) zeigt, dass bei Bewegung die Golgi-Stapel ERESs an ihrer Peripherie sammeln. ERES verschwinden nach BFA-Behandlung nicht, stattdessen kommt es zu deutlichen morphologischen Veränderungen im Golgi-Apparat. Die Verhinderung des ER-Exports durch Expression einer Sar1-Mutante, die im GDP-Status angehalten ist, führt zu einem teilweisen Verlust der sichtbaren ERESs.