German Title: Untersuchung der Funktion eines zellulären Mechanismus bei Infektion mit HIV und Evaluierung neuer antiviraler Therapeutika

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Abstract

The human immunodeficiency virus (HIV) is the causative agent of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). Despite more than twenty years of intense research still no vaccine or curing therapy has been found. For the development of novel antiviral compounds, understanding of the HIV lifecycle as well as the molecular mechanisms of host pathogen interactions are a prerequisite. Like all viruses, HIV subcontracts cellular machineries for efficient replication and production of new progeny. A particular feature of lentiviruses is the active transport of the pre-integration complex (PIC) into the nucleus. The mechanism remains elusive, yet in the case of HIV the viral protein R (Vpr), a small 14kDa accessory protein, is one candidate possibly implicated in the process. The protein stays associated to the PIC until nuclear translocation. Furthermore it has been shown, that Vpr binds to the nuclear pore complex (NPC). This interaction might therefore be the link mediating nuclear import of the PIC. Moreover the cytoskeleton has been shown to play a major role in cytoplasmic transport of viral particles. In this context, we observed the nuclear envelope (NE) to be embedded in a perinuclear actin shell and displaying highly dynamic nuclear invaginations. We developed a novel approach to visualize actin inside living cells based on a fluorescent analog of cytochalasin D (CD-BODIPY). Due to specific binding to free-barbed-ends of short actin fibers, we could show that this compound visualizes a high turnover actin pool around the NE and inside NE-membrane invaginations of living cells. Although reported in many different cell types, the possible role of perinuclear actin filaments in the dynamic structural plasticity of the NE remains unresolved. We could show that NE-membranes alone are sufficient to nucleate polymerizing actin filaments in vitro, involving both actin recruitment to their surface, and filament growth. Accordingly, our results demonstrate that perinuclear actin dynamics are orchestrated by the NE itself. Therefore, by binding of Vpr to the NPC, the virus could possibly exploit this pool of polymerizing actin as a new strategy to overcome the nuclear membrane. Furthermore, we tested peptide nucleic acids (PNAs) as new compounds to inhibit viral spread at different stages of the lifecycle. PNAs have been developed recently and dispose of several features to be a powerful tool for a novel antisense approach. We synthesized a series of PNAs directed against crucial sequences in the HIV genome and tested them under various conditions. This showed in particular, that infectivity of virions produced in the presence of PNAs was significantly diminished. In another viral system, PNAs targeted against the borna disease virus (BDV), could provide evidence for the requirement of the surface glycoprotein (GP) in BDV infection. Moreover, the treatment could effectively inhibit viral spread in primary neurons. These results demonstrate PNAs to be a powerful molecular tool and a potential antiviral drug candidate.

Translation of abstract (German)

Das Humane Immundefizienzvirus (HIV) ist der Auslöser der erworbenen Immunschwächekrankheit (AIDS). Seit mehr als zwanzig Jahren wird intensive Forschung betrieben, um mehr Verständnis für die Biologie dieses Virus zu erlangen. Dennoch konnten bisher weder ein Impfstoff noch eine das Virus vollständig eliminierende Therapie entwickelt werden. Das Verständnis des viralen Lebenskreislaufs auf der einen Seite und des Zusammenspiels von Gastzelle und Pathogen auf der anderen Seite ist eine grundlegende Vorraussetzung für die Entwicklung neuer antiviraler Strategien. Viren nutzen zelluläre Mechanismen für ihre eigene Replikation und Vermehrung. Eine ausserordentliche Fähigkeit von Lentiviren ist der aktive Transport ihres Präintegrationskomplexes (PIC) durch die intakte Kernmembran. Die molekulare Grundlage dieses Vorgangs ist bis heute noch nicht bekannt. Im Falle von HIV gibt es allerdings Hinweise, dass das akzessorische virale Protein R (Vpr) eine Rolle bei diesem Vorgang spielt. Das Protein begleitet den PIC bei seinem Weg durch das Zytoplasma bis zu dessen Kontakt mit der Kernmembran. Vpr bindet an Komponenten des Kernporenkomplexes (NPC), und es besteht die Möglichkeit, dass Vpr durch diese Wechselwirkung den Kerntransport des PICs vermittelt. Beim Transport viraler Partikel durch das Zytoplasma spielt das Zytoskelett eine maßgebliche Rolle. In diesem Zusammenhang stellten wir fest, dass der Zellkern von einem Geflecht an Actin umgeben ist und hoch dynamische Invaginationen der Kernmembran aufweist. Um Actin in lebenden Zellen darzustellen, haben wir eine neue Methode entwickelt, die auf der Verwendung einer fluoreszierenden Form von Cytochalasin D (CD-BODIPY) basiert. Diese Droge bindet spezifisch an das schnell wachsende Ende (free-barbed-end) von Actinfilamenten. Mit Hilfe dieses Systems konnten wir zeigen, dass die Kernmembran von stark polymerisationsaktivem Actin umgeben ist, und dass dieses Actin tief in die Invaginationen der Kernmembran hineinreicht. Ein den Zellkern umgebendes Actingeflecht wurde bereits früher beschrieben, allerdings war die Bedeutung und Auswirkung auf die Struktur des Zellkerns nicht bekannt. In dieser Arbeit konnten wir nun zeigen, dass isolierte und aufgereinigte Kernmembranen in vitro ausreichen, um die Polymerisierung von Actin zu initiieren. Dieser Vorgang beinhaltet sowohl die Bindung von Actin an die Kernmembran als auch das Wachstum von Filamenten. Dementsprechend demonstrieren unsere Ergebnisse, dass die Zellkernmembran per se in der Lage ist, dieses spezielle Actinreservoir zu manipulieren. Das HI-Virus könnte nun durch die Bindung von Vpr an den NPC das beschriebene zelluläre Phänomen ausnutzen, um durch eine lokal Induktion der Polymerisierung von Actin die Kernmembran zu überwinden. Des Weiteren, haben wir Peptid Nuklein Säuren (PNAs) auf ihre Fähigkeit als neuartige antivirale Präparate hin untersucht. PNAs wurden erst kürzlich entwickelt und stellen dank ihrer hervorragenden biochemischen Misch-Eigenschaften eine neue und sehr vielversprechende Möglichkeit dar, Genexpression spezifisch zu inhibieren. In dieser Hinsicht haben wir eine Reihe von PNAs synthetisiert, die gegen essentielle Sequenzen im Genom von HIV gerichtet sind, und haben ihre Wirksamkeit in einer Vielzahl von Versuchsanordnungen untersucht. Hiermit konnten wir zeigen, dass virale Partikel an Infektiosität verlieren, wenn sie in Anwesenheit von PNAs produziert werden. In einem anderen viralen Versuchssystem konnten wir unter Verwendung von PNAs, die gegen die Sequenzen des Glycoproteins des Borna Disease Virus (BDV) gerichtet sind, die Notwendigkeit des Hüllproteins von BDV für den Infektionsprozess aufzeigen. Außerdem konnte durch die PNA-Behandlung eine Ausbreitung des Virus in primären Neuronen blockiert werden. Diese Ergebnisse qualifizieren PNAs sowohl als leistungsfähige Hilfsmittel für die Grundlagenforschung als auch eine vielversprechende Möglichkeiten im Hinblick auf den Einsatz als antivirale Therapeutika.