English Title: Characterization of the Alzheimer Disease associated gene product Presenilin 1 and interaction with beta-catenin

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Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurden zuerst Fragestellungen bearbeitet, die sich auf das Presenilin 1 Protein allgemein, auf dessen Prozessierung zu C- und N-terminalen Fragmenten und die physiologisch vorliegende Form als Heterodimer bezogen. Es wurde untersucht, unter welchen Bedingungen sich Volllängen-PS1 Protein und PS1-Fragmente in überexprimierenden Zellen und Gewebepräparationen aus Rattenhirn nachweisen lassen. Das Volllängenprotein wurde nur bei PS1-transfizierten SH-SY5Y Zellen und einer Inkubationstemperatur von 37 °C vor Gelauftrag nachgewiesen. Eine Inkubation bei 100 °C führte zur Aggregation des Proteins im hochmolekularen Bereich. Das N- und C-terminale Fragment ließ sich auch bei Wildtyp-SH-SY5Y Zellen und Behandlung der Probe bei 37 °C nachweisen. Eine Inkubation bei 100 °C zeigte eine Tendenz zur Aggregation mit zunehmender Zahl der Transmembrandomänen, so dass eine Aggregation des PS1-Volllängenproteins und N-terminalen Fragments, nicht aber des C-terminalen Fragments zu beobachten war. Im Rattenhirngewebe waren nur die Fragmente, nicht aber das PS1-Volllängenprotein nachzuweisen Diese Ergebnisse wurden publiziert (Beher D., Elle C., Underwood J., Davis J., Ward R., Karran E., Masters C., Beyreuther K., and Multhaup G. (1999) J. Neurochem. 72, 1564-1573). Um weitere Untersuchungen zum Presenilin 1 durchführen zu können, war es erforderlich, geeignete Antikörper gegen PS1 herzustellen. Für die Gewinnung von Antikörpern gegen das C-terminale Fragment wurde der PS1 „loop“-Bereich rekombinant aufgereinigt und als Antigen eingesetzt. Weiterhin wurden N-terminale PS1-Bereiche als GST-Fusionsproteine exprimiert und nach der Aufreinigung als Antigene zur Gewinnung von Antikörpern gegen das N-terminale Fragment eingesetzt. Die so gewonnenen Antikörper wurden auf ihre Spezifität und ihre Funktionalität in „Western Blot“ Analysen sowie in der Immunpräzipitation überprüft. Die hergestellten Antikörper gegen den C-terminalen PS1-Bereich sind für die Immunfällung als auch für die „Western Blot“ Detektion geeignet, während die Antikörper gegen den N-terminalen PS1-Bereich in der Immunfällung sehr gute Ergebnisse liefern und bei der „Western Blot“ Detektion von unterschiedlicher Qualität sind. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit bestand in der Analyse der Interaktion zwischen PS1 und dem bei der sowohl Interaktion von Zellen beteiligten als auch intrazellulär wichtigen Protein b﷓Catenin. Zur Verifizierung der Interaktion wurden die in dieser Arbeit hergestellten Antikörper verwendet. Mit Hilfe von Koimmunpräzipitationsexperimenten ist es gelungen, sowohl die Interaktion zwischen PS1-NTF und PS1-CTF nachzuweisen als auch die Interaktion des PS1-Heterodimers mit b-Catenin. Die subzelluläre Lokalisation dieser Proteine wurde mit Hilfe von Immunfluoreszenzanfärbung überprüft. In in SH-SY5Y Zellen und MDCK Zellen zeigte PS1 vor allem eine Anfärbung im Bereich von ER und Golgi, während es in primären, hippokampalen Neuronen auch im Bereich von Synapsen angefärbt wurde. b-Catenin war vor allem an der Plasmamembran und schwächer auch im Zellkern und Cytosol von MDCK Zellen lokalisiert. Da PS1 eine essentielle Komponente des g-Sekretase Enzymkomplexes darstellt, wurde der Frage auf den Grund gegangen, ob eine erhöhte b-Catenin Menge Einfluß haben könnte auf die Produktion oder Sekretion des bei der Alzheimer Krankheit wichtigen Ab-Peptids. Mit Hilfe einer Lithiumchloridbehandlung von MDCK Zellen konnte durch Inhibition der GSK3b ein Aktivieren des Wnt-Signaltransduktionsweges nachgeahmt werden, was zu einer Anreicherung des intrazellulären b﷓Catenins führte. Gleichzeitig konnte festgestellt werden, dass die Menge an sekretiertem Ab-Peptid in Abhängigkeit von der Lithiumkonzentration als auch der Inkubationszeit erhöht war. Es wurde davon ausgegangen, dass b-Catenin, dessen Menge durch GSK3b reguliert wird, als Ligand von PS1 einen Einfluß auf die g-Sekretaseaktivität von PS1 ausüben könnte.