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Abstract

Das Hepatitis C Virus (HCV) induziert Leberentzündungen, die sich zu Leberzirrhosen und hepatozellulären Karzinomen entwickeln können. Im Jahr 2021 weisen schätzungsweise 58 Millionen Menschen chronische HCV Infektionen auf und im Jahr 2019 sind 290.000 Menschen an Konsequenzen von HCV-induziertem Leberversagen gestorben. Diese Daten stellen das HCV als eine große globale Gesundheitsbelastung dar. Mit der Entwicklung von direkt am Virus ansetzenden Medikamenten hat sich die Heilungsrate der behandelten Patienten drastisch erhöht. Der geringe Zugang zu Diagnose und Behandlung aufgrund hoher Kosten sowie das Auftreten arzneimittelresistenter Mutanten machen jedoch deutlich, wie wichtig die weitere Erforschung von HCV im Hinblick auf die Entwicklung eines prophylaktischen Impfstoffs und die breite Verfügbarkeit antiviraler Medikamente ist, um die globale Ausrottung von Hepatitis C zu erreichen. Zwei Aspekte, die noch nicht in ausreichender Tiefe aufgeklärt wurden, sind die Rolle von Cholesterol im HCV-Replikationszyklus und wie Lipidtröpfchen (LDs, von Engl. „Lipid droplets“) zum Zusammenbau infektiöser Viruspartikel beitragen könnten. Meine Doktorarbeit befasste sich daher mit zwei komplementären Aspekten. Die erste befasste sich mit dem Mechanismus, wie Cholesterol zur HCV-Replikation und Virusproduktion beiträgt. Um diese Frage zu klären, untersuchte ich HCV-Proteine auf direkte Interaktion mit Cholesterol. Dazu wurde das photoaktivierbare und klickbare (PAC, von Engl. „photoactivatable and clickable“) Cholesterol zur Quervernetzung von eng benachbarten Proteinen verwendet. Ich fand heraus, dass das Nichtstrukturprotein 2 (NS2) am effizientesten mit PAC-Cholesterol quervernetzt wurde. Durch die anschließende systematische Untersuchung von 20 NS2-Mutanten auf PAC-Cholesterol-Quervernetzung und die 3D-Modellierung der NS2-Transmembran-domäne wurde ein sogenanntes CRAC-Motiv (von Engl. „cholesterol recognition amino acid consensus“) im dritten Transmembransegment von NS2 (Aminosäurerest 87-94) identifiziert. Das CRAC-Motiv ist verantwortlich für die NS2-Cholesterol-Interaktion, wobei der Aminosäurerest Tyr 91 den Hauptbeitrag zur Cholesterol-bindung leistete. Die virologische Analyse von NS2-CRAC-Mutanten zeigte die wichtige Rolle der NS2-Cholesterol-Interaktion für die Produktion infektiöser Viren. Eine weitere Charakterisierung von NS2-CRAC-Mutanten unter Verwendung von Immunfluoreszenz- (IF) und Co-Immunpräzipitationsassays lieferte Hinweise darauf, dass die Cholesterolbindung von NS2 für dessen Interaktion mit dem Hüllprotein E2 erforderlich sein könnte. Diese ist höchstwahrscheinlich notwendig, um E2 zur Produktionsstelle von HCV-Partikeln zu rekrutieren. Außerdem habe ich Beweise dafür gesammelt, dass die NS2-Cholesterol-Interaktion an der Modulation der späten Endosomenmobilität und der subzellulären Cholesterolkonzentration beteiligt sein könnte. Der zweite Aspekt meiner Dissertation beschäftigte sich mit der Rolle von LDs bei der Assemblierung infektiöser HCV-Partikel. Das virale Protein core, welches das Kapsid bildet, und NS5A, eine Komponente des viralen Replikasekomplex, lokalisieren direkt auf LDs. Bemerkenswerterweise werden in der späten Phase des HCV-Replikationszyklus die viralen Hüllproteine zu NS5A-dekorierten LDs rekrutiert, und diese E2-/NS5A-doppelt positiven LDs werden eng von ER-Membranen umgeben. Da dieses Einfangen von LDs durch das endoplasmatische Retikulum (ER) von der Virusassemblierung abhängt, nahmen wir an, dass diese LDs Virion-Assemblierungsstellen entsprechen, was den Lipidtransfer von LDs zum ER ermöglicht und somit die Bildung von Lipid-umhüllten HCV-Partikeln fördert. Für die Etablierung von Kontakten zwischen ER und LDs wurde die Ras-verwandte kleine GTPase Rab18 als wichtiger Wirtsfaktor angesehen. Rab18 ist nicht nur dafür verantwortlich, ER-Membranen in engen Kontakt mit LDs zu bringen, sondern unterstützt auch den HCV-Replikationszyklus. Um den möglichen Beitrag von Rab18 zur HCV-Virionenproduktion zu untersuchen, habe ich Rab18-Knockout (KO)-Zelllinien generiert und detailliert charakterisiert. Wie erwartet, konnte ich die wichtige Rolle von Rab18 für die Herstellung von ER - LD-Kontakten bestätigen. Aufgrund von Off-Target-Effekten, die sogar in Kontrollzellen beobachtet wurden, konnten jedoch keine reproduzierbaren HCV-Phänotypen bestimmt werden. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass NS2 eine starke Cholesterolbindung über ein CRAC-Motiv aufweist, das eine entscheidende Rolle bei der Assemblierung infektiöser HCV-Partikel spielt. Ich ziehe die Schlussfolgerung, dass die NS2-Cholesterol-Interaktion für die Interaktion zwischen NS2 und den viralen Hüllproteinen notwendig sein könnte, wodurch letztere zu cholesterolreichen HCV-Montagestellen rekrutiert werden.