German Title: Quantitative Herangehensweisen zum Verständnis der Zell-zu-Zell Bewegung des Homeodomänen Transkriptionsfaktors WUSCHEL (WUS) im Sprossapikalmeristem von Arabidopsis thaliana

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Abstract

A plants capacity to continuously generate new organs and tissues is fueled by pluripotent stem cells, embedded in specialized niche tissues, called meristems, which provide strict regulation of stem cell fate to balance the need for cell proliferation and cell differentiation. In the Arabidopsis shoot apical meristem (SAM), maintenance of a stable stem cell population largely depends on the non-cell autonomous activity of the homeodomain transcription factor WUSCHEL (WUS). WUS mRNA is expressed in the organizing center (OC) within the L3 of the shoot meristem. From here, WUS protein moves several cell layers upwards towards the overlying L2 and L1 and into the stem cells in the central zone (CZ). While it has been shown that short-ranged cell-to-cell movement of the WUS protein, via cytoplasmic bridges called plasmodesmata, is essential for WUS function and shoot stem cell maintenance, many aspects of WUS mobility, including its mechanism and regulation, remain unclear or under debate. Here, I chose a quantitative approach to characterize WUS mobility: For this, I have developed a semi-automated analysis pipeline for layer-specific quantification of fluorescence intensity along the apical-basal axis of the SAM, taking into account meristem curvature. I have then used this analysis in combination with high-resolution live-cell imaging on dissected, unfixed shoot apices to systematically characterize the mobility of differently tagged WUS fusion proteins in complementation lines as well as transcriptionally inactivated mutant alleles in wildtype meristems. From these data, I hypothesize that the mechanism for WUS mobility in the SAM involves a component of active transport that is not directional but regulated via protein retention in the L3. Considering previous studies, my data further indicates that specificity of active WUS movement may be mediated by the WUS homeodomain (HD) and suggests the presence of regulatory sequences not only in the unstructured region between WUS HD and WUS box, but also at the N- and C-terminus.

Translation of abstract (German)

Die Fähigkeit einer Pflanze, kontinuierlich neue Organe und Gewebe zu generieren wird ermöglicht durch das Vorhandensein pluripotenter Stammzellen innerhalb spezialisierter Stammzellnischen (Meristemen), die die Notwendigkeit für Zellproliferation, aber auch für Zelldifferenzierung, abstimmen und regulieren. Im Sprossapikalmeristem von Arabidopsis thaliana ist diese Regulierung der Stammzellpopulation zu einem großen Teil abhängig von der Aktivität des Homeodomänen Transkriptionsfaktors WUSCHEL (WUS). WUS mRNA wird im Sprossmeristem im sogenannten organisierenden Zentrum, einem Bereich in tiefer liegenden Zellschichten (L3), exprimiert. Von dort bewegt sich das WUS Protein mehrere Zellen nach oben, in die Stammzellen innerhalb der darüber liegenden Zellschichten L2 und L1. Auch wenn wir wissen, dass diese Zell-zu-Zell Bewegung, mittels zytoplasmatischer Verbindungen (Plasmodesmata), essentiell für die Funktion von WUS und die Aufrechterhaltung der Stammzellpopulation ist, sind der genau Mechanismus und dessen Regulierung, weitgehend ungeklärt oder werden kontrovers diskutiert. In dieser Arbeit, habe ich quantitative Ansätze zur Charakterisierung der WUS Mobilität verfolgt: Hierfür habe ich eine teilautomatisierte Analyse zur Quantifizierung von Fluoreszenzintensität entlang der apikal-basal-Achse des Sprossmeristems, unter Berücksichtigung der Gewebekrümmung, entwickelt. In Kombination mit hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie habe ich so die Bewegung unterschiedlicher WUS Fusionsproteine im Kontext von Komplementierungslinien und im Wildtyp Hintergrund charakterisiert. Basierend darauf schlage ich vor, dass WUS Mobilität eine aktive, nicht-direktionale Komponente beinhaltet, die ihre Spezifität durch die WUS Homeodomäne erhält. Meine Daten lassen vermuten, dass dieser Transportmechanismus durch Protein-Protein Interaktionen in der L3 reguliert wird, für die innerhalb des WUS Proteins, zusätzlich zu bereits beschriebenen Proteinsequenzen, der N- und C-Terminus wichtig sind.