English Title: Establishment and comparison of antigen loading methods for dendritic cells as basis for immunotherapies of cervical cancer

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Abstract

Humane Papillomviren (HPV) sind mit der Zervixkarzinogenese assoziiert. Die HPV-Typen 16 und 18 sind die prävalentesten HPV-Genotypen im Zervixkarzinom. Die Onkoproteine E6 und E7 dieser Viren werden konstitutiv in infizierten zervikalen Tumorzellen exprimiert und werden deswegen als tumorassoziierte Antigene angesehen. HPV-infizierte Keratinozyten induzieren keine ausreichende zelluläre Immunantwort in Zervixkarzinompatientinnen. Eine mögliche Ursache dafür könnte die fehlende Expression von kostimulatorischen Signalmolekülen der Tumorzellen sein, die für eine Aktivierung naiver T-Zellen notwendig ist. Autologe dendritische Zellen (DZ), die potentesten antigenpräsentierenden Zellen, sollten als Adjuvans für eine zelluläre Immuntherapie an Zervixkarzinompatientinnen effizient mit HPV-E7-Antigenen beladen werden. Nach Etablierung der Kultur- und Differenzierungsbedingungen für DZ, wurde die Beladung mit HPV-E7-Antigenen in Form von in vitro transkribierter RNA, Expressionsplasmid bzw. rekombinant exprimiertem Protein mittels Induktion spezifischer T-Zellen ausgetestet und verglichen. Die RNA- und DNA-Beladung waren ineffizient. Dagegen konnten Protein-beladene DZ in > 80% der untersuchten gesunden Donoren eine HPV16-E7- bzw. HPV18-E7-spezifische CD4+ und/oder CD8+T-Zellantwort in vitro induzieren. Die Anwendung Protein-beladener DZ wurde auf Patientinnen übertragen. DZ konnten auch aus Zervixkarzinompatientinnen generiert und mit HPV-E7-Protein beladen werden. Tumorinfiltrierende Lymphozyten aus Zervixkarzinomen wurden ex vivo mit Protein-beladenen DZ stimuliert. Es wurde gezeigt, daß bei 2/12 Zervixkarzinompatientinnen HPV-E7-spezifische T-Zellen aktiviert werden konnten. In einer Serie von individuellen Heilversuchen an terminalen HPV16 bzw. 18 positiven Zervixkarzinompatientinnen wurde die Verträglichkeit der DZ-Vakzine, sowie klinisches und immunologisches Ansprechen untersucht. Bei 15/15 Versuchspersonen wurden keine systemischen oder lokalen Nebenreaktionen beobachtet. Trotz transienten Abfalls des Tumormarkers SCC bei 5/10 Patientinnen wurde kein objektives klinisches Ansprechen im Sinne von progressionsfreiem Überleben festgestellt. Das Immunomonitoring zeigte die Induktion einer spezifischen serologischen Reaktion bei 1/12 evaluierbaren Patientinnen. Die Induktion von HPV-E7-spezifischen T-Zellen wurde nach Vakzinierung bei 4/10 Patientinnen gefunden. Diese Ergebnisse zeigen, daß DZ von Zervixkarzinompatientinnen generiert, mit rekombinantem HPV16-E7- bzw. HPV18-E7-Protein beladen und gefahrlos appliziert werden können. Die positive immunologische Reaktion in einigen Patientinnen bietet die Grundlage für eine klinische Studie unter optimierten und standardisierten Bedingungen.

Translation of abstract (English)

Human papillomavirus (HPV) infection is associated with the development of cervical cancer. HPV types 16 and 18 are the most prevalent HPV genotypes in cervical cancers. The oncoproteins E6 and E7 of these viruses are constitutively expressed in infected cervical tumor cells and thus are considered to be tumor associated antigens. HPV infected keratinocytes fail to induce an efficient cellular immune response in cervical carcinoma patients probably due to the absence of costimulatory molecules crucial for naive T cell priming. Autologous dendritic cells (DC), the most potent antigen presenting cells, had to be loaded efficiently with HPV-E7 antigen and used as adjuvant for cellular immune therapy in cervical carcinoma patients. The cultur and differentiation conditions for DC were established. The loading of DC with HPV-E7 antigen by in vitro transcribed RNA, DNA-vector for eucaryotic expression and recombinantly expressed protein was analysed and compared by specific T cell induction. Loading by RNA and DNA was not efficient. In contrast, DC pulsed with protein induced a HPV16-E7 or HPV18-E7 specific CD4+ and/or CD8+ T cell response in > 80% healthy donors. Therefore, we used protein pulsed DC for analysing T cell response in patients. DC of cervical carcinoma patients could be generated and loaded with HPV-E7 protein. Tumor infiltrating lymphocytes (TIL) of cervical carcinoma biopsies were stimulated ex vivo with protein loaded DC. In 2/12 patients HPV-E7 specific TIL could be directly activated. In a series of individual compassionate therapies in terminal HPV16 and 18 positive patients the tolerance and the clinical and immunological response of the DC based vaccine were analysed. No systemic or local side effects were observed in 15/15 vaccinated patients. Although 5/10 patients showed a transient decline of the tumor marker SCC, no objective clinical response, as defined by survival without progression, was detected. The immunomonitoring showed the induction of one specific serological response in 12 patients evaluated. Induction of HPV-E7 specific T cells was found in 4/10 patients after vaccination. These data demonstrate that generation, HPV16 or HPV18-E7 protein loading and safe application of DC in cervical carcinoma patients is feasible. The postive immunological reaction in some patients presents a basis for a clinical study under optimized and standardized conditions.