English Title: Recombinat Hepatitis B Virus-Vectors as Tools for Molecular Biology and Therapy : Optimizing a System

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Abstract

Hepatitis B Virus (HBV) - Vektoren sind vielversprechende Kandidaten für einen lebergerichteten Gentransfer, da sie bevorzugt Hepatozyten infizieren und ihre Genexpression hepatozytenspezifisch ist. Es war bekannt, dass infektiöse HBV produziert werden konnten, in denen das kleine Hüllprotein (S) durch das grün fluoreszierende Protein (GFP) ersetzt wurde. Nach Infektion primärer humaner Hepatozyten (PHH) mit diesen Viren zeigten einzelne Zellen eine grüne Fluoreszenz. Der Einsatz von HBV-Vektoren ist einerseits als Werkzeug in der Molekularbiologie und andererseits in der Therapie von Lebererkrankungen denkbar. In der vorliegenden Arbeit sollte der Nachweis eines Gentransfers verbessert sowie die Transgenkapazität exakt bestimmt und vergrößert werden. Im Hinblick auf eine mögliche Therapie von chronischer Hepatitis B oder C sollte ein lebergerichteter Interferontransfer etabliert werden. Der Gentansfers in Hepatozyten durch Infektion konnte erst reproduzierbar untersucht werden, als PHH als Testsystem für die Vektoren etabliert waren und die Virusausbeute durch die Verwendung von Lipofektion sowie serumfreiem Medium bei der Virusproduktion 10fach erhöht wurde. Durch das Ersetzen des preS2/S-Promoters durch den Transthyretin-Promoter konnte eine Infektion von lebenden PHH zu einem früheren Zeitpunkt nachgewiesen werden, ohne die Leberspezifität des Promotors zu verlieren. Mit Renilla-Luziferase als Transgen gelang es, den Nachweis einer Infektion zu vereinfachen und quantifizierbare Ergebnisse zu erhalten. Diese Viren ermöglichten es, die Transgenkapazität und die Genexpression der HBV-Vektoren genauer zu untersuchen. Da die HBV-Vektoren eine über 400 bp hinausgehende Überlänge des Genoms nicht tolerierten, konnte die Transgenkapazität von ca. 800 bp nur durch Einführung weiterer Deletionen im viralen Genom vergrößert werden. Eine andere genomische Deletion erhöhte die Genexpression 5fach. Für einen lebergerichteten Interferontransfer wurden sowohl adenovirale Vektoren als auch HBV-Vektoren benutzt. Mit beiden Systemen gelang es, Viren zu produzieren, und mit beiden Vektoren war es auch möglich, Interferon-Expression in infizierten PHH nachzuweisen. Durch diese Verbesserungen stellen die HBV-Vektoren ein Werkzeug zur mikroskopischen Identifikation infizierter, lebender PHH in Zellkultur da. Mit den Luziferase exprimierenden Viren ist es möglich, die Infektion einer gesamten Kulturschale zu quantifizieren und den Einfluss von Änderungen im viralen Genom auf Infektiösität, Transkription und Genexpression zu untersuchen. Interferon exprimierende HBV-Vektoren werden aktuell im Schimpansen Modell der chronischen Hepatitis C getestet.

Translation of abstract (English)

Hepatitis B Virus (HBV) - vectors are promissing candidates for a liver directed gene transfer and may be valuable tools for molecular biology and therapy of liver diseases. They preferentially infect hepatocytes and their gene expression is liver specific. HBV-derived vectors carrying a green fluorescent protein (GFP) had been produced. Using these for infection of primary human hepatocytes (PHH), successful gene transfer was shown. However, transgene expression was at the detection limit. The aim of the study presented was to improve the detection of gene transfer and to exactly determine and enlarge the transgene capacity of HBV based vectors. HBV-vectors expressing human interferons should be developed for application in gene therapy of chronic hepatitis B and C. As a basis for these investigations, systematic attempts were undertaken to improve PHH cultures with respect to HBV infection. Vector production was improved and yields could be increased 10fold using lipofection and serum free media. To enhance gene expression, a transthyretin-promoter was inserted instead of the viral preS2/S-Promoter. Thus, GFP expression was detected earlier without loosing liver specificity. A simple and quantitative assay to measure efficacy of infection and gene transfer using renilla-luciferase as a marker was established. This assay made it possible to determine the transgene capacity of the HBV-vector. A genomic over length of more than 400 bp was not tolerated. The transgene size was limited to ca. 1200 bp when the original, S-deleted vector was used. After introduction of further genomic deletions in the HBV core gene a 1600 bp transgene could be inserted. A distinct deletion enhanced the gene expression 5fold. HBV- and adenoviral-vectors have been produced for a liver directed gene transfer of human interferons. Both systems lead to interferon expression after infection of PHH. The improvements obtained during this study made HBV-vectors a useful tool for the identification of living, successfully infected cells in culture. Luciferase expressing vectors allow to quantify infection in an entire culture dish and allow to determine the influence of various factors on infectivity and transgene expression of HBV-vectors. Interferon expressing vectors may now be tested in chimpanzee models of hepatitis B and C.