German Title: Kommunikation in Pflanzen: Analyse und Modellierung von Calcium-Signaturen in Arabidopsis thaliana

Preview

PDF, English - main document Download (39MB) | Terms of use

Abstract

Plants have a sessile lifestyle and cannot run away when attacked. They have therefore developed various defense systems to deal with potential predators or bacteria and fungi. But heat, drought or high concentrations of salt in the water also mean stress for the plant. Calcium plays an important role as a signaling molecule in the transmission of the stress stimulus within the plant. Plants of the species Arabidopsis thaliana can be genetically modified so that their calcium concentration is visible under the microscope. These plants were stimulated by my cooperation partners with various biotic and abiotic stress stimuli and recorded with the camera. As a response, the time-lapse recordings show a locally limited increase in the intracellular calcium concentration close to the root tip, which runs in waves through the plant.

The aim of my work was to analyze the wave qualitatively and quantitatively and to investigate the connection between the type of stimulus and the spatio-temporal pattern of the wave, the calcium signature. By means of modeling, I investigated how this wave can propagate at high speed across cell boundaries and how different responses to a calcium signal can be triggered at the protein level. The course of the calcium wave can be displayed as a kymograph, a space-time diagram. Using the kymograph, I managed to quantify the wave and to determine characteristic parameters such as start time, start position, and speed. The image series of the individual experiments show a high variance with respect to intensity and shape of the calcium wave. To the purpose of convenient evaluation, I designed an analysis script that quantifies the calcium wave automatically. Firstly, the root is detected in an image series. Secondly, a kymograph is created from the mean calcium concentration along the root. Finally, the calcium wave is plotted as a thin, sharply outlined line. This so-called crestline plot highlights the characteristic properties of the individual wave and allows an easy approximation of aforementioned wave parameters. The analysis of the experiments revealed that stimulation with salt leads to an immediate, short-term increase in the calcium concentration, while bacteria or fungi trigger a delayed calcium wave that propagates at a speed of a few µm/s.

It is known from the literature that after stimulation of the root with elevated levels of salt, the wave moves through the plant at a high speed of around 400 µm/s. A combined signal transmission of intracellular calcium and extracellular reactive oxygen species (ROS) is suggested as a possible explanation. Together with my cooperation partner, I designed a corresponding mathematical model and adapted it to the different cell sizes in the root tip. We were able to show that wave propagation based only on intracellular calcium is sufficient for the much slower calcium wave after stimulation with bacteria or fungi. However, the calcium wave after stimulation with salt requires additional components. Based on a simulation, I was able to demonstrate that the plasmodesmata, the narrow tubes between adjacent cells, slow down the expansion of the wave considerably and should not be ignored.

The plant can use calcium-dependent protein kinases (CPKs) to decode the calcium signal and translate it into protein phosphorylations as a starting point for further reactions. For example, the closing process of the stomata is based on the calcium-regulated activation of CPKs. Based on experimental data, I developed a CPK protein model for different CPKs. In a computer simulation, I coupled calcium time series from a stimulation experiment of guard cells and epidermal cells to my protein model and examined the activity of the CPK proteins. I was able to show that by varying the calcium signal, different CPK proteins can be addressed and the stress response of the plant can be adapted to the type of stimulation.

Translation of abstract (German)

Pflanzen pflegen einen sesshaften Lebensstil und können nicht einfach weglaufen, wenn Sie angegriffen werden. Sie haben daher verschiedene Abwehrsysteme entwickelt, um mit potentiellen Fressfeinden oder Bakterien und Pilzen fertig zu werden. Aber auch Hitze, Trockenheit oder hoher Salzgehalt des Wassers bedeuten Stress für die Pflanze. Bei der Weiterleitung des Stressreizes innerhalb der Pflanze spielt Calcium als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Pflanzen der Art Arabidopsis thaliana können genetisch so modifiziert werden, dass ihre Calciumkonzentration unter dem Mikroskop sichtbar ist. Diese Pflanzen wurden von meinen Kooperationspartnern mit verschiedenen biotischen und abiotischen Stressreizen stimuliert und dabei mit der Kamera aufgezeichnet. Die Zeitrafferaufnahmen zeigen als Reaktion einen lokal begrenzten Anstieg der intrazellulären Calciumkonzentration nahe der Wurzelspitze, welcher wellenartig durch die Pflanze läuft. Ziel meiner Arbeit war es, die Welle qualitativ und quantitativ zu analysieren und einen möglichen Zusammenhang zwischen der Art des Stressreizes und dem räumlich-zeitlichen Muster der Welle, der sogenannten Calcium-Signatur, zu erforschen. Mittels Modellierung untersuchte ich, wie sich diese Welle mit hoher Geschwindigkeit über Zellgrenzen hinweg ausbreiten kann und wie auf Proteinebene unterschiedliche Reaktionen auf ein Calciumsignal ausgelöst werden können.

Der Verlauf der Calciumwelle kann als Kymograph, als Raum-Zeit-Diagramm, dargestellt werden. Mittels computergestützter Auswertung des Kymographen war es mir möglich, die Welle zu quantifizieren und charakteristische Kenngrößen wie Startzeitpunkt, Startposition und Geschwindigkeit zu bestimmen. Die Bilderserien der einzelnen Experimente weisen eine hohe Varianz bezüglich Intensität und Erscheinungsbild der Calciumwelle auf. Um deren Auswertung zu erleichtern, habe ich ein Analyseskript entwickelt, das die Quantifizierung der Calciumwelle vollautomatisch durchführt. Dabei wird zunächst die Wurzel in den Bilderserien detektiert, aus der mittleren Calciumkonzentration entlang der Wurzel ein Kymograph erstellt und darin dann die Calciumwelle als dünne scharf umrissene Linie eingezeichnet. Dieser sogenannte Crestline-Plot macht die charakteristischen Eigenschaften der einzelnen Welle deutlich und erlaubt eine einfache Abschätzung der oben erwähnten Kenngrößen. Die Analyse der Experimente ergab, dass Stimulation mit Salz zu einer sofortigen kurzzeitigen Erhöhung der Calciumkonzentration führt, während Bakterien oder Pilze eine Calciumwelle auslösen, die mit Verzögerung einsetzt und sich mit einer Geschwindigkeit von wenigen µm/s ausbreitet.

Aus der Literatur ist bekannt, dass sich die Welle nach Stimulation der Wurzel durch eine Erhöhung der Salzkonzentration mit einer Geschwindigkeit um die 400 µm/s durch die Pflanze fortbewegt. Als mögliche Erklärung wird eine kombinierte Signalweiterleitung aus intrazellulärem Calcium und extrazellulären Reactive Oxygen Species (ROS) genannt. Zusammen mit meinem Kooperationspartner habe ich ein entsprechendes mathematisches Modell erstellt und an die unterschiedlichen Zellgrößen in der Wurzelspitze angepasst. Wir konnten zeigen, dass eine nur auf intrazellulärem Calcium basierende Signalweiterleitung für die wesentlich langsamere Calciumwelle nach Stimulation mit Bakterien oder Pilzen ausreichend ist während die Calciumwelle nach Stimulation mit Salz die Einbeziehung zusätzlicher Komponenten erfordert. Mittels Computersimulation konnte ich demonstrieren, dass die Plasmodesmata, die schmalen Verbindungsgänge zwischen benachbarten Zellen, die Ausbreitung der Welle erheblich bremsen und nicht vernachlässigt werden dürfen.

Die Dekodierung des Calciumsignals und dessen Übersetzung in Proteinphosphorylierungen als Ausgangspunkt für weitere Reaktionen kann in der Pflanze durch Calcium-abhängige Proteinkinasen, sogenannte CPKs, erfolgen. Zum Beispiel basiert der Schließvorgang der Spaltöffnungen auf der Calcium-gesteuerten Aktivierung von CPKs. Auf der Grundlage von experimentellen Daten aus der Literatur habe ich ein CPK-Proteinmodell für verschiedene CPKs entwickelt. In einer Computersimulation habe ich Calcium-Zeitreihen aus einem Stimulationsexperiment von Schließzellen und Epidermiszellen an mein Proteinmodell gekoppelt und die Aktivität der CPK-Proteine untersucht. Ich konnte zeigen, dass durch Variierung des Calcium-Signals unterschiedliche CPK-Proteine angesprochen werden können und damit die Stressantwort der Pflanze auf die Art der Stimulierung abgestimmt werden kann.