English Title: Identification of Microdomain Proteins and functional Characterization of Cholesterol in the Golgi Apparatus

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Abstract

Mittels Detergenzextraktion von Golgimembranen bei 0°C mit anschließender Dichtegradientenzentrifugation wurden sphingolipid- und cholesterinreiche Mikrodomänen isoliert, die zehn Proteine entsprechend der Coomassiefärbung in der SDS-PAGE enthalten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die zwei bisher nicht charakterisierten Proteine mit Molekulargewichten von 72 und 56 kDa als Untereinheiten A und B der vakuolären ATPase identifiziert. Daneben konnte mit NAP-22 eine elfte Komponente identifiziert werden, die nur in der Silberfärbung als prominentes Protein erscheint. Bei Hemmung der v-ATPase mit Bafilomycin A1 wird der Transport von Proteinen vor dem Erreichen des TGN inhibiert. Der Protein Transport zwischen intrazellulären Kompartimenten wird durch eine Proteinmaschinerie gesteuert. Während die beteiligten Proteine eingehend untersucht wurden, ist wenig über den Einfluss von Lipiden bekannt. Durch Verwendung eines zellfreien Intra-Golgi-Transportassays konnte gezeigt werden, dass Cholesterin hier eine entscheidende Rolle spielt. Kleine Veränderungen des Cholesteringehalts (+/-10) führen zu einer spezifischen Inhibition des Intra-Golgi-Transports (70 Inhibition). Dies gilt sowohl für die Addition als auch die Depletion. Die Cholesterinextraktion führt zu einer Inhibition der Fusionsreaktion, wie die Verwendung von BFA im Intra-Golgi-Transportassay zeigt. Cholesterin findet sich sowohl in der liquid disordered als auch in der liquid ordered phase. Die Extraktion von Cholesterin erfolgt aus beiden Phasen in gleichem Maße. Im Unterschied dazu wird bei der Zugabe das Cholesterin bevorzugt in die liquid ordered phase eingebaut. Die geringfügigen Veränderungen des Cholesteringehalts führen zur Änderungen des Solubilisierungsverhaltens ausgewählter Golgi Proteine, nämlich der heterotrimeren G-Proteine. Wird Cholesterin mittels MethylbetaCD-Cholesterin-Komplexen zu intakten CHO-Zellen gegeben, so wurde eine Vesikulierung der Golgi-Struktur beobachtet.

Translation of abstract (English)

Extraction of Golgi membranes with detergent at 0°C and subsequent density gradient centrifugation was used to isolate spingolipid and cholesterol rich microdomains which contain 10 major proteins according to coomassie staining after SDS-PAGE. The two so far not identified proteins with apparent molecular weights of 72 and 56 kDa were identified as subunit A and B of the vacuolar ATPase. In addition NAP-22 was found to be a prominent protein in the microdomains according to silver staining. Inhibition of the v-ATPase by Bafilomycin A1 leads to a block in the transport of proteins before they reach the TGN. Protein transport between intracellular organelles is facillitated by a protein machinery. Whereas the proteins involved in this process are well studied only limited data is available regarding the role of lipids. By use of a cell-free intra-Golgi transport assay it could be demonstrated that cholesterol plays an important role in this transport step. Small Variations (+/-10) of the cholesterol content leads to a specific inhibition of intra-Golgi transport (70 Inhibition). The cholesterol extraction results in an inhibition of the fusion reaction as could be shown by the use of Brefeldin A in the transport assay. Cholesterol participates in the liquid ordered as well as in the liquid disordered phase. The extraction of cholesterol reduces the cholesterol content in both phases to the same extent. On the contrary the added cholesterol is preferentially incorporated into the liquid ordered phase. The small variations of the cholesterol content leads to a changed solubilisation behaviour of certain Golgi proteins which are in particular heterotrimeric G proteins. If cholesterol was added to intact cells a dispersal of the Golgi structure could be observed.