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Unraveling the pathology of different disease severities in human cerebral organoid models of LIS1-lissencephaly

Krefft, Olivia

German Title: Untersuchung der Pathologie von verschiedenen Schweregraden in menschlichen zerebralen Organoid Modellen von LIS1-Lissenzephalie

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Abstract

The human neocortex is greatly expanded and exhibits a highly organized and extensively folded (gyrencephalic) structure. Model systems gave a fundamental understanding about how the cortex is generated although the applied models often involve species with a smooth (lissencephalic) brain surface, such as mice. Thus, key cellular events that impact human-specific brain expansion and our understanding of how disease-linked mutations disrupt human cortical development remains elusive. Lissencephaly is a malformation of cortical development which is characterized by a smooth brain and a disorganized cortex. Heterozygous deletions or mutations in the LIS1 gene, encoding a microtubule-associated protein in humans, were identified to cause lissencephaly with diverse clinical phenotypic variations ranging from mild pachygyria (broad gyri) to severe agyria (no gyri) resulting in epilepsy and intellectual disabilities. While the clinical severity generally correlates with the degree of agyria, the location and type of mutation in the LIS1 gene does not. From LIS1 mouse models we know that LIS1 regulates the microtubule motor cytoplasmic dynein and by that dynein-dependent processes such as neuronal migration, nucleokinesis, interkinetic nuclear migration and mitotic spindle orientation. Even though the observed LIS1-deficiency-associated phenotypes appeared drastically milder in murine systems compared to humans these studies suggest that LIS1 gene dosage is relevant for the phenotypic severities. However, why a specific mutation within the LIS1 gene as identified in LIS1-lissencephalic patients (LIS1-patients) leads to different disease severities and whether human-specific processes during cortical development are differentially affected by the specific mutations could, due to a lack of adequate model systems, so far not been investigated. Here, I explore the ability to recapitulate different disease severities of LIS1-lissencephaly using LIS1-patient-specific iPS cells and thereof derived forebrain-type cerebral organoids. To do so, I selected from a LIS1-patient cohort comprising 63 cases 7 patients who cover the whole spectrum of gyrification alterations of LIS1-lissencephaly ranging from Dobyns grade 5 (mild) to 1 (severe). Each patient harbors a different molecular characterized heterozygous mutation in the LIS1 gene. To analyze the consequences of each LIS1 mutation on human brain development a 3D cell culture forebrain-organoid protocol was developed. Following reprogramming of patient-derived somatic cells and basic characterization (2 clones each) the iPS cells were applied to the organoid protocol. Organoids reproduced, in correlation with the patient’s severity, alterations in organoid cytoarchitecture and premature neurogenesis. To assess the direct consequences of the patient-specific mutations on LIS1 microtubule stabilizing function I investigated the stability of the cytoskeleton of apical (a) RG cells within the cortical ventricular-like zone (VZ) structures and found a progressive collapse of tubulin strand stability with increasing patient disease severity leading to a disruption of cellular organization. These phenotypic alterations could in part be reversed by stabilizing the microtubule array using the FDA-approved drug EpothiloneD. In addition, organoids from individuals with severe but not mild disease showed a non-random aRG cell division switch from proliferative to neurogenic division. As an underlying molecular cause, WNT-signaling alterations were identified, most prominently in severe conditions. To test to what extend perturbed WNT-signaling contributes to the observed patient-specific alterations, organoids were exposed to the GSK3ß inhibitor CHIR99021 leading to a significant rescue of non-random aRG cell division switch in severe organoids and to enlarged VZ diameters as well as reduced neurogenesis in all patient derived organoids. The here demonstrated research underlines the capability of cerebral organoids to sensitively model individual disease severities, a so far not addressed major challenge of the system. My data show that different patient-specific mutations in the LIS1 gene have divergent direct impact on microtubule stability, which directly and/or indirectly lead to perturbed human corticogenesis providing the missing link between the patient-specific LIS1 mutation and the clinical severity grade. Future applications analyzing individual diseases have the potential to advance personalize medicine and improve the understanding of individual pathology for personalized therapy.

Translation of abstract (German)

Lissenzephaly ist eine kortikale Entwicklungsstörung, die durch ein glattes Gehirn und einen unstrukturierten Cortex charakterisiert ist. Mutationen im LIS1 Gen wurden als häufigste Ursache für diese Erkrankung identifiziert. LIS1-Lissenzephaly zeichnet sich dadurch aus, dass Betroffene unterschiedlich schwer erkrankt sind. Einige haben verbreitete kortikale Einfaltungen, sogenannte Gyri und zeigen milde Krankheitsverläufe, andere wiederum sind schwer betroffen und haben ein glattes Gehirn ohne Gyri. Analysen in murinen Systemen konnten bislang nicht die Gesamtheit der Erkrankung widerspiegeln, zeigten jedoch, dass die Dosierung von LIS1 für die Schwere der Erkrankung relevant ist. Dennoch konnte die Frage, warum eine spezifische Mutation im LIS1 Gen, wie sie bei den Erkrankten identifiziert wurden, zu unterschiedlichen Ausprägung der Erkrankungen führt, durch das Fehlen von adäquaten Modellsystem, bisher nicht beantwortet werden. Das gleiche gilt für die Frage, ob die unterschiedlichen Mutationen human-spezifische Entwicklungsprozesse differenziert beeinflussen. Aus diesem Grund habe ich zusammen mit meinen Kollegen ein Protokoll für die Generierung von zerebralen Organoiden entwickelt und dessen Fähigkeit untersucht, verschiedene Schweregrade von LIS1-Lisenzephaly widerzuspiegeln. Hierfür wurden 7 unterschiedlich schwer erkrankte (mild, moderate und schwer) Lissenzephaly Patienten aus einer 63 Patienten Kohorte ausgewählt, bei welchen die Erkrankung durch eine molekular charakterisierte heterozygote Mutation im LIS1 Gen hervorgerufen wird. Um die Konsequenzen der einzelnen Patienten-spezifischen Mutationen auf die humane Gehirnentwicklung zu untersuchen, wurden von jedem Patienten somatische Zellen zu Stammzellen zurückprogrammiert, um 3D zerebrale Organoide zu generieren. Diese in vitro Gewebe zeigten krankheits-assoziierte phänotypische Veränderungen, die in ihrer Ausprägungsstärke mit den Schweregrad der Patienten korrelierten. Entwickelte Quantifizierungsprotokolle zeigten mit zunehmenden Schweregrad eine progressive Veränderung der kortikalen Ventrikular-Struktur-Dimensionen sowie verfrühte Neurogenese. Um die direkte Konsequenz der Patienten-spezifischen Mutationen auf die LIS1 Mikrotubuli-stabilisierende Funktion zu untersuchen, wurde das astrale Zytoarchitekutur-stabilisierende Zytoskelett analysiert und ein progressiver Zusammenbruch mit zunehmender Schwere der Erkrankung festgestellt, was zu einer zellulären Unordnung innerhalb des in vitro Gewebes führte. Die Behandlung der zerebralen Organoide mit EpothiloneD, ein Mikrotubuli-stabilisierendes FDA-genehmigtes Medikament, konnte die Zytoarchitektur stabilisieren und somit partiell die zelluläre Ordnung wiederherstellen. Darüber hinaus zeigte die Untersuchung der Teilungsorientierung von apikalen Radialgliazellen, dass es in Organoiden, die von Zellen von schwer (weniger von moderat und mild) Erkrankten generiert wurden, eine spezifische Umorientierung von proliferativer zu neurogener Zellteilung gibt, was zu verfrühter Neurogenese und kleineren Ventrikular-Strukturen führte. Bei mild und moderat Erkrankten zeigten die Zellen dagegen überwiegend eine unspezifische Fehlorientierung der Zellteilungsebene, die ebenfalls, jedoch weniger stark ausgeprägt, im Vergleich zu schweren Bedingungen, zu verfrühter Neurogenese führte. Als molekulare Ursache für die spezifische Umorientierung der Zellteilungsebene konnte eine Störung der WNT Signalübertragung ermittelt werden, so dass der Zellteilungsstörung mit GSK3ß Inhibierung (WNT Signalübermittlungsaktivierung) entgegengewirkt werden konnte. Meine Forschung zeigt, dass zerebrale Organoide sensitiv genug sind, um unterschiedliche Schweregrade einer Erkrankung widerzuspiegeln, eine zuvor nicht bewiesene große Herausforderung des in vitro Systems. Die Daten zeigen, dass die verschiedenen Patienten-spezifischen Mutationen im LIS1 Gen die Mikrotubuli-stabilisierende Funktion von LIS1 direkt unterschiedlich beeinflussen, was direkt (zelluläre Unordnung) oder indirekt (WNT-Signalübermittlungsstörungen) zu einer gestörten Entwicklung des Gehirn führt. Damit konnte diese Arbeit den bisher fehlenden Zusammenhang zwischen Patienten-spezifischen Mutationen und klinischen Schweregrad aufklären. Des Weiteren konnten involvierte Pathomechanismen spezifisch für den Schweregrad aufgedeckt und therapeutische Substanzen identifiziert werden, die den Krankheitsverläufen in vitro entgegenwirkten. Der zukünftige Einsatz von Organoiden für die Untersuchung von individuellen Krankheitsverläufen könnte personalisierte Medizin verbessern und zu einem tieferen Verständnis von Patienten-spezifischen Pathologien für personalisierte Therapien führen.

Document type: Dissertation
Supervisor: Koch, Prof. Dr. Philipp
Place of Publication: Heidelberg
Date of thesis defense: 30 September 2020
Date Deposited: 08 Dec 2020 09:46
Date: 2020
Faculties / Institutes: The Faculty of Bio Sciences > Dean's Office of the Faculty of Bio Sciences
DDC-classification: 500 Natural sciences and mathematics
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