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Abstract

Das Hepatitis B Virus (HBV) kann zu chronischer Leberinfektion führen und ist ein Risikofaktor für die Entstehung von Leberzirrhose und dem hepato-zellulären Karzinom. Für die Persistenz des Virus ist die Bildung und die Aufrechterhaltung der kovalent geschlossenen zirkulären DNS („covalently closed circular“ (ccc)DNS) zwingend notwendig, da sie als episomale Matrize für die Transkription im Kern der infizierten Hepatozyten dient. Die an cccDNS gebundene virale Transkription hängt vom HBV X Protein (HBx) sowie den durch HBx initiierten Abbau des wirtsspezifischen Restriktionsfaktors „structural maintenance of chromosome 5/6“ (SMC5/6) ab. Eine Grundvoraussetzung für die Ubiquitinierung und den Abbau von SMC 5/6 ist, dass HBx das Protein “DNA damage-binding protein1“ (DDB1) bindet und somit den Cullin 4A Ringligasekomplex rekrutiert, welcher für seine Aktivierung neddyliert werden muss.

Nachdem eine verlässliche quantitative PCR etabliert wurde konnte die Kinetik der cccDNS Bildung in vier verschiedenen in vitro Infektionsmodellen sowie der Einfluss von Medikamenten (Interferon-α, Nukleos(t)id-Analoga,Inhibitoren des viralen Zelleintritts(„entry Inhibitor“) und Kapsid-Inhibitoren) auf die cccDNS untersucht werden. Im Vergleich zum Replikationsintermediat der gelockerten zirkulären („relaxed circular“; (rc)DNS) sind die Kopienzahlen der cccDNS in infizierten Hepatozyten niedrig (1-6 Kopien/infizierter Zelle). Der „entry Inhibitor“ Myrcludex B unterband effizient die (ccc)DNS Bildung. Hohe Interferon-α Dosen verringerten die cccDNS Menge während Nukleos(t)id-Analoga diese nicht vermindern konnten. Die Gabe von Kapsid Inhibitoren während der Infektionsphase, aber nicht zu einem späteren Zeitpunkt, führte zu einer Verringerung der cccDNS Menge.

Indem wir HBx negative Virionen für die Infektion verwendet haben, konnten wir die Schlüsselrolle von HBx in der Kontrolle der cccDNS Transkription verifizieren. Wird HBx transient von einem authentischen Promotor exprimiert befindet es sich im Zellkern. Mit Hilfe eines lentiviral basierten Transkomplementationsansatzes, in dem die Transkription von HBx defizienten Virionen auf das Level von Wildtypviren gehoben wurde, konnten Schlüsselfragmente und -bereiche des HBx bestimmt werden. Der gesamte C-Terminus von HBx (Aminosäuren 51-154) war sowohl ausreichend als auch unentbehrlich um die Replikation HBx-defizienter Viren wieder herzustellen während der N-Terminus (Aminosäuren 1-50) keine transaktivierende Funktion aufzeigte. Zusätzlich waren zwei kürzere Fragmente (Aminosäure 51-142 und 58-142) teilweise funktional. Bemerkenswerterweise wies die HBx Mutante(R96E), welche nur noch eine geringe Bindeaktivität zu DDB1 aufweist, überhaupt keine Transaktivierungsaktivität mehr auf, was darauf hindeutet, dass die Bildung des HBx-DDB1 Komplexes für die maximal mögliche Transkription der cccDNS nötig ist.

Des Weiteren untersuchten wir ob eine Hemmung der Neddylierung die Transkription erschwert. MLN4924, ein spezifischer Inhibitor des NEDD8-aktivierenden Enzyms 1 zeigte ein bemerkenswertes antivirales Potenzial. MLN4924 verringerte die HBV Transkription und virale Antigenexpression wirksam in nanomolarer Dosierung. Nach der Bildung der cccDNS unterdrückte das Medikament hochgradig die Transkription selbiger ohne dabei die cccDNS Menge zu beeinflussen. Die Unterbrechung der MLN4924 Gabe führte in HepaRGNTCP Zellen nicht zu einer Reaktivierung der cccDNS Transkription, wohingegen in HepG2NTCP Zellen eine schnelle Erholung von HBV beobachtet wurde. Bemerkenswerter Weise wurde die Transkription der cccDNS HBx-defizienter Viren nicht signifikant beeinfluss, was darauf schließen lässt, dass der MLN4924 Effekt auf das Wildtypvirus HBx-abhängig ist. MLN4924 verringert dabei selektiv die Transkription aller HBV Promotoren im Kontext der cccDNS, jedoch nicht bei integrierter viraler DNA. MLN4924 verhinderte der Abbau von SMC6,förderte dessen Wiederherstellung und unterband somit die Transkription der cccDNS.

Zusammenfassen lässt sich sagen, dass nukleäres HBx DDB1 bindet, den Abbau von SMC6 induziert und so die Transkription der cccDNS fördert. Ein Angriff auf die Neddylierung unterbindet die Transkription der cccDNS und stellt die SMC6-abhängige Restriktion der cccDNS wieder her. Somit friert eine MLN4924 Behandlung die cccDNS in einem Zustand der „transkriptionellen Stille“ ein. Kleine Moleküle, die auf den HBx-DDB1-Cullin Komplex zielen könnten somit eine Vorausschau auf die nächstmögliche Therapie für HBV sein.

Translation of abstract (English)

Hepatitis B Virus (HBV) leads to chronic infection of the liver and is a risk factor for the development of cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Virus persistence requires the establishment and maintenance of covalently closed circular (ccc)DNA, serving as the episomal template for transcription of viral genes in the nucleus of infected hepatocytes. Viral cccDNA-dependent gene expression requires HBV X protein (HBx) and HBx-mediated degradation of the host restriction factors structural maintenance of chromosome 5/6 (SMC5/6). A prerequisite for SMC5/6 ubiquitination and degradation is that HBx binds DNA damage-binding protein 1 (DDB1) and further recruits Cullin 4A ring ligase complex, which requires neddylation for its activation.

After the establishment of a reliable quantitative PCR, the kinetics of cccDNA formation in four in vitro infection systems and the effect of drugs (interferon-a, nucleos(t)ide analogues, entry inhibitors, and capsid inhibitors) on cccDNA were analyzed. Compared to replicative relaxed circular (rc)DNA, copy numbers of cccDNA in infected hepatocytes are unexpectedly low (1~6 copies per infected cell). Entry inhibitor, Myrcludex B, efficiently blocked cccDNA formation. Interferon-a reduced cccDNA level at high dose, whereas nucleos(t)ide analogues did not reduce it. Treatment with capsid inhibitors during the infection phase but not afterward led to a decline of cccDNA levels.

Using HBx-minus virion for infection, we verified HBx as a key controller of cccDNA transcription. HBx expressed by its authentic promoter showed nuclear localization. Using lentiviral-based transcomplementation assay to restore the transcription of HBx-minus virus to the wild-type level, key fragments and residues of HBx were identified. The whole C-terminus of HBx (51~154 amino acids) was sufficient and indispensable to enhance transcription of HBx-minus virus, whereas N-terminal HBx (1~50 amino acids) displayed no transactivation. In addition, two shorter truncations (51~142 and 58~142 amino acids) showed residual function. Remarkably, the HBx(R96E) mutant with impaired binding activity to DDB1 totally abolished its transactivation activity, supporting that foundation of the HBx-DDB1 complex is required for maximal transcription from cccDNA.

We further investigated whether blockage of neddylation hampers transcription. MLN4924, a specific NEDD8-activating enzyme 1 inhibitor, was identified to notably possess antiviral potential. MLN4924 potently reduced HBV transcription and viral antigen expression at nanomolar doses. After the establishment of cccDNA, the drug profoundly suppressed transcription from cccDNA without affecting cccDNA levels. Withdrawal of MLN4924 did not lead to restoration of cccDNA transcription in HepaRGhNTCP cells, however fast HBV rebound was observed in infected HepG2hNTCP cells. Peculiarly, transcription from cccDNA of HBx-minus virus was not significantly affected, suggesting that MLN4924 effect on wild-type virus replication is HBx dependent. MLN4924 selectively reduced transcription from all HBV promoters on cccDNA but not integrants. MLN4924 prevented SMC6 from degradation and the restoration of SMC6, in turn, silenced transcription from cccDNA.

Taken together, nuclear HBx binds DDB1, induces SMC6 degradation and thereby promotes transcription from cccDNA. Targeting neddylation blocks transcription from cccDNA and restores SMC6 restriction on cccDNA. Therefore, MLN4924 treatment traps cccDNA in “transcriptional silence”. Small molecules that target the HBx-DDB1-Cullin complex might be foresight as the next possible therapeutic option combating HBV.