German Title: Die Untersuchung von hematopoietischen Differenzierungsmustern anhand der genomweiten Analyse von progressiven DNA Methylierungsveränderungen

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Abstract

Hematopoietic stem cells (HSCs) are responsible for the life-long production of all mature blood cells. The classical hierarchical model of hematopoiesis has been revised based on single-cell transcriptome analyses to suggest a continuous rather than a step-wise differentiation process. While differentiation trajectories can be inferred from single-cell transcriptional snapshots, it remains a challenge to identify definitive points of lineage commitment. The molecular characterization of such commitment decisions is required to accurately model the hematopoietic system. The analysis of 5-methylcytosine may facilitate the identification of such molecular commitment marks due to the progressive nature of how DNA methylation is programmed during differentiation. In this doctoral thesis, a genome-wide DNA methylome map of murine hematopoiesis was generated using tagmentation-based whole genome bisulfite sequencing, encompassing 26 hematopoietic cell populations. Across all populations, 147,232 differentially methylated regions (DMRs) were identified and grouped into coordinately regulated regions by hierarchical clustering. These dynamically regulated regions showed progressive and unidirectional DNA methylation programming during normal hematopoietic differentiation. The DNA methyltion programs can be interpreted as pan-hematopoietic, lineageand cell type-specific, indicating a molecular mechanism of cell fate restriction. The lineage specificity of the DNA methylation programs was confirmed by the enrichment of hematopoietic transcription factor binding motifs and lineage-specific enhancer programs. Strikingly, lineage-specific DMRs were already identified within the multipotent hematopoietic stem and progenitor compartment, supporting the concept of early lineage restriction. Furthermore, a model of murine hematopoiesis could be inferred in form of a diffusion map that is purely based on DNA methylation dynamics during hematopoietic differentiation. To gain further insights into how DNA methylation dynamics relate to the regulation of gene expression, a single-cell transcriptome map of the entire murine hematopoietic system was generated. The integration of DNA methylation dynamics with single-cell gene expression patterns provided evidence for an anti-correlation between DNA methylation and cell-type specific gene expression patterns. However, loss of DNA methylation was not invariably associated with an increase in gene expression. This suggests that DNA methylation has more a permissive rather than an instructive role in regulating lineage-specific transcriptional programs. Finally, the DNA methylome map was used as a resource to investigate epigenetic patterns that underlie the myeloid and megakaryocytic lineage bias observed in aged mice. By comparing the DNA methylomes of young and aged HSCs, 3,275 DMRs were identified, which were predominantly associated with a loss of DNA methylation in genes involved in integrin signaling, platelet activation, and platelet aggregation. Notably, 46% of these DMRs overlapped with DNA methylation patterns identified in normal hematopoietic differentiation and significantly affected DNA methylation programs showing low DNA methylation levels in megakaryocyte-primed cell populations. Together, these findings suggest that HSC aging alters the DNA methylome in vivo, in a manner that is associated with a increased differentiation towards the megakaryocytic lineage. In summary, the DNA methylome map of murine hematopoiesis generated in this thesis provides novel insights into the epigenetic regulation of hematopoietic differentiation and complements recent findings from single-cell transcriptome studies. Furthermore, it represents a rich resource to investigate DNA methylation patterns in hematopoiesis across a broad range of conditions.

Translation of abstract (German)

Hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind für die lebenslange Produktion aller reifen Blutzellen verantwortlich. Das klassische hierarchische Modell der Hämatopoese wurde basierend auf Einzelzell-Transkriptomanalysen weiterentwickelt, so dass nun ein kontinuierlicher Differenzierungsprozess postuliert wird. Obwohl Differenzierungstrajektorien aus Einzelzell-Transkriptomen abgeleitet werden können, bleibt es eine Herausforderung, den definitiven Differenzierungspunkt zu bestimmen. Die molekulare Charakterisierung solcher Differenzierungspunkte ist jedoch essenziell, um das hämatopoetische System im Detail zu verstehen. Die Analyse von 5-Methylcytosin könnte aufgrund der kontinuierlichen und robusten DNA Methylierungsveränderungen während des Differenzierungsprozesses die Identifizierung solcher molekularen Differenzierungspunkte ermöglichen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurde ein genomweiter DNA-Methylierungsdatensatz bestehend aus 26 murinen hämatopoetischen Zellpopulationen generiert. Im gesamten hämatopoetischen System wurden 147.232 differentiell methylierte Regionen (DMRs) identifiziert, welche durch hierarchische Clusteranalyse in koordiniert regulierte Regionen gruppiert wurden. Diese dynamisch regulierten Regionen zeigten progressive und unidirektionale DNA Methylierungsveränderungen während der normalen hämatopoetischen Differenzierung und wurden als pan-hämatopoetische, linien- und zelltypspezifische DNA-Methylierungsprogramme interpretiert. Die biologische Relevanz dieser Programme wurde durch die Anreicherung von hämatopoetischen Transkriptionsfaktor-Bindungsmotiven und linienspezifischen Enhancer-Programmen bestätigt. Hervorzuheben ist, dass bereits im multipotenten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellkompartiment linienspezifische DMRs identifiziert wurden, was auf eine frühe hämatopoetische Differenzierung hindeutet. Des Weiteren konnte mithilfe des sogenannten Diffusions-Algorithmus ein Modell der murinen Hämatopoese abgeleitet werden, welches lediglich auf DNA-Methylierungsdynamiken während der Blutbildung basiert. Um den Zusammenhang zwischen DNA-Methylierung und Genexpression zu untersuchen, wurde ein Einzelzell-Transkriptomdatensatz des gesamten hämatopoetischen Systems erstellt. Die Integration von DNA-Methylierungs- und Transkriptionsdynamiken weißt auf eine allgemeine Anti-Korrelation dieser molekularen Mechanismen hin. Jedoch war ein DNAMethylierungsverlust nicht zwingend mit einer Zunahme der Genexpression verbunden, was vermuten lässt, dass ein Verlust der DNA-Methylierung die Zelle lediglich auf potenzielle Transkriptionsprogramme vorbereitet, welche im Verlauf der Differenzierung an-, aber auch wieder abgeschaltet werden können. Im abschließenden Teil dieser Doktorarbeit wurden die generierten DNA-Methylome als Ressource verwendet, um epigenetische Muster zu untersuchen, die der verstärkten myeloiden und megakaryozytären Differenzierung in der Blutbildung gealterter Mäuse zugrunde liegen. Beim Vergleich des Methyloms von jungen und gealterten HSZ wurden 3.275 DMRs identifiziert. Diese DMRs waren überwiegend durch Methylierungsverlust charakterisiert und betrafen Gene, die an Integrin-Signalwegen, Blutplättchenaktivierung und Blutplättchenaggregation beteiligt sind. Bemerkenswerterweise überlappten 46% dieser DMRs mit den DNA-Methylierungsveränderungen der normalen hämatopoetischen Differenzierung, welche vorwiegend eine niedrige DNA-Methylierung in megakaryozytären Zellpopulationen aufweisen. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der Alterungsprozess von HSZ mit DNA-Methylierungsveränderungen einhergeht, die eine megakaryozytäre Differenzierung begünstigen. Zusammenfassend liefert der vorliegende DNA-Methylomdatensatz der murinen Hämatopoese neue Erkenntnisse über die epigenetische Regulation der hämatopoetischen Differenzierung und ergänzt die kürzlich gewonnenen Erkenntnisse aus Einzelzell-Transkriptomstudien. Darüber stellt dieser Datensatz eine umfassende Ressource dar, um Veränderungen der DNA-Methylierungsmuster in der normalen oder malignen Hämatopoese zu untersuchen.