English Title: Analysis of structure, function and evolution of the astacin protein family

Preview

PDF, German Download (5MB) | Terms of use

Abstract

Astacin (E.C. 3.4.24.21) aus dem Magen des Flusskrebses Astacus astacus ist der Prototyp einer Familie von Zink-Endopeptidasen, deren Mitglieder bei Vertebraten, Invertebraten und Bakterien gefunden werden. Bei dem Nematoden Caenorhabditis elegans konnte die überraschend große Zahl von 40 Astacin-homologen Genen identifiziert werden. Eine Transkriptom-Analyse ergab, dass mit Ausnahme eines Pseudogens alle anderen Astacine tatsächlich exprimiert werden. GFP-Reporter-Proteine zeigten für zwei Astacine eine Verdauungsfunktion und eine entwicklungsrelevante Rolle. Bei einer Proteom-Analyse durch 2D-Elektrophorese konnten neue Proteine der C. elegans Proteinkarte zugeordnet werden. Bei dem Modellorganismus Hydractinia echinata konnten zwei neue Astacin-homologe Gene charakterisiert werden, die als HEA-1 und HEA-2 bezeichnet wurden. In situ Hybridisierungen deuten eine Rolle bei der Kopfbildung und bei der Differenzierung von Tentakelzellen an. Durch BLAST- und FASTA-Suchen in den Datenbanken konnten insgesamt 106 verschiedene Astacin-homologe Proteine gefunden werden. Die phylogenetische Analyse und die Analyse der Domänenstruktur ließen ein allgemeines Evolutions-Prinzip erkennen, wonach die katalytische Kette des Astacins nach Anhängung von regulatorischen Einheiten als ein Modul in unterschiedlicher Umgebung und mit neuen Funktionen eingesetzt werden kann. Weiterhin erlaubte die Stammbaum-Analyse eine Einteilung der Astacine in mehrere phylogenetische Gruppen. Als Modellprotein für die Untersuchung des Aktivierungsmechansimus von Pro-Astacinen wurde das Flusskrebs-Astacin verwendet. Die immunhistochemischen, proteinbiochemischen und die massenspektrometrischen Untersuchungen von Substrat-Peptiden zeigten, dass Pro-Astacin in Astacus astacus autokatalytisch im proximalen Bereich des Hepatopankreas vor Übertritt in den Magen aktiviert wird. Darüber hinaus konnte auch gezeigt werden, dass die Mehrzahl der Pro-Astacine ebenfalls autokatalytisch aktiviert werden kann.

Translation of abstract (English)

Astacin (E.C. 3.4.24.21), a digestive protease from the freshwater crayfish Astacus astacus, is the prototype for the astacin protein family of zinc-endopeptidases. Members of this family occur in organisms from bacteria to man and serve in a wide variety of physiological processes. Using the genome sequencing data a remarkably high number of 40 genes coding for astacin homologs were identified in the nematode C. elegans. The transcriptom analysis revealed that excluding one pseudogene all other astacins are expressed. Futhermore, GFP reporter-gene fusions for two astacins indicated functions involved during development and general protein digestion. A proteome analysis with 2D-gel-electrophoresis localized new protein spots on the C. elegans protein reference map. In Hydractinia echinata two new astacin-homolog genes named HEA-1 and HEA-2 were identified and characterisized. In situ hybridisation suggested a functional role in head development during metamorphosis and differentiation of tentacle cells. Search of the genome sequence databases using the BLAST and FASTA algorithm resulted in at least 106 annotated astacin-like sequences. Phylogenetic analyses and the multidomain structures of these proteins indicated an evolutionary process, called domain shuffling. Thus the catalytic domain of astacin can be used as a modul that can be integrated into other proteins. Furthermore, phylogenetic analyses revealed the classification of astacins into distinct subfamilies or groups. To contribute to the knowledge of the processing and activation of pro-astacins, the crayfish astacin was studied. Immunhistochemical, biochemical and mass spectrometerical investigations of substrate peptides showed that pro-astacin in Astacus astacus is autocatalytically activated during its progress from the tubular lumen of the hepatopancreas to the cardiac stomach. In addition it could be shown that the majority of other pro-astacins also are capable of catalyzing their own activation.