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Abstract

Melanoma is the most common form of cancer. Thus, test systems for the development of new drugs and therapies are required that resemble the in vivo situation. Currently, most cell-based assays are performed in two-dimensional (2D) cell cultures. While cells cultured in 2D monolayers appear to be flat and stretched allowing for equal exposure to medium and drugs, three-dimensional (3D) structures of cells are more realistic to the in vivo situation displaying cells of varying stages of the cell cycle, i.e. proliferating cells on the periphery of the 3D structure, followed by quiescent and necrotic cells in the center. Several 3D cell culture approaches that exhibit varying degrees of complexity have been developed to perform drug testing and mechanistic studies on melanoma. Although 3D cell culture systems of melanoma are superior to traditional 2D approaches, these 3D cultures are either composed of only one cell type, the melanoma cells, or they are so complex that it is challenging to understand the behavior of individual cell types. Additionally, they are often difficult to establish and expensive. Therefore, this work aimed to establish a novel, simple, spheroid-based melanoma model. This study used low-attachment plates to generate spheroids that are composed of up to three different cell types, i.e. stromal, skin, and cancer cells. To study differences in culture conditions and behavior of normal and neoplastic cells, 3D cultures of these cell types were compared. 3D cultivation revealed decreasing volume sizes of normal cells, fibroblasts and keratinocytes, with only few proliferating cells on the periphery of the spheroids. In contrast, neoplastic cells, SK-MEL-28, LNCaP, and PC-3 cells, displayed increasing volume sizes with proliferating cells on the outside of the spheroids. All tested cell types showed a significant reduction of proliferation with a concurrent rise of apoptosis in 3D compared to 2D cultures. The presented tri culture model allowed the study of cellular behavior in a cell-type specific way and represented different features of early melanoma stages. Fibroblasts formed a collagen IV rich center of the tri-culture spheroid, keratinocytes built up a ring around this center, and melanoma cells arranged highly proliferating clusters on the outside. Some melanoma cells were also found regularly in the fibroblast core. In the absence of melanoma cells, keratinocytes stratified into an inner basal-like ring and more differentiated cells on the periphery. In contrast, addition of melanoma cells clearly reduced keratinocyte differentiation. Upon treatment with the cytostatic drug, docetaxel, this keratinocyte differentiation was restored and apoptosis of external melanoma cells was induced. Furthermore, docetaxel treatment significantly increased the amount of immunoreactivity to the transporter protein ABCB5 in remaining intact external melanoma cells. Taken together, a novel, simple, spheroid-based melanoma tri-culture model composed of fibroblasts, keratinocytes, and melanoma cells was described. This can now be applied for the development of new drugs and the analysis of their cell type specific mode of action.

Translation of abstract (German)

Das Melanom, besser bekannt als schwarzer Hautkrebs, ist die häufigste Krebsart. Daher besteht der Bedarf nach einem in vivo nahen Testsystem für die Entwicklung neuer Medikamente und Therapien. Derzeit werden die meisten zellbasierten Untersuchungen mit Hilfe der zweidimensionalen (2D) Zellkultur durchgeführt. Zellen, die als 2D Einzelschicht kultiviert werden, sehen phänotypisch flach und gestreckt aus, wohingegen im lebenden Organismus Zellen in einem dreidimensionalen (3D) Verbund wachsen. Dies hat zur Folge, dass in der 2D Zellkultur eine gleichmäßige Exposition zu Medium und Medikamenten vorliegt, welche nicht der in vivo Situation entspricht. Zudem zeigen 3D kultivierte Zellen unterschiedliche Stadien des Zellzyklus, das heißt proliferierende Zellen an der Peripherie der 3D Struktur, gefolgt von ruhenden und nekrotischen Zellen im Zentrum. Es wurden bereits einige 3D Zellkulturkonzepte unterschiedlicher Komplexität für Arzneimittelprüfungen und mechanistische Untersuchungen an Melanomen entwickelt. Obwohl 3D Zellkultursysteme von Melanomen den traditionellen 2D Methoden überlegen sind, bestehen bisherige 3D Systeme entweder nur aus einem Zelltyp, den Melanomzellen, oder sind so komplex, dass es schwierig ist, das Verhalten einzelner Zelltypen zu verstehen. Zusätzlich sind diese komplexen 3D Systeme oft schwer zu etablieren und teuer. Daher ist das Ziel dieser Arbeit, ein neuartiges, einfaches, sphäroidbasiertes Melanommodell zu etablieren. Für die Herstellung der Sphäroide wurden beschichtete Platten verwendet, die ein Anheften der Zellen verhindern. In diese wurden bis zu drei verschiedene Zelltypen, Stroma , Haut- und Krebszellen, ausgesät. Um Unterschiede in den Kultivierungsbedingungen und dem Verhalten von normalen und neoplastischen Zellen zu untersuchen, wurden 3D Kulturen dieser Zelltypen miteinander verglichen. Die 3D Kultivierung ergab einen reduzierten Umfang der Sphäroide von normalen Zellen, Fibroblasten und Keratinozyten, mit nur wenigen proliferierenden Zellen an der Peripherie der Sphäroide. Dagegen präsentierten neoplastische Zellen, SK-MEL-28, LNCaP und PC-3 Zellen, eine zunehmende Größe der Sphäroide mit proliferierenden Zellen an deren Außenseite. In 3D Monokulturen zeigten alle getesteten Zelltypen eine signifikante Abnahme der Proliferation mit gleichzeitigem Anstieg an Apoptose im Vergleich zu 2D. Mit Hilfe des hier vorgestellten Trikulturmodells war es möglich, das zelluläre Verhalten von Stroma , Haut- und Krebszellen zelltypspezifisch zu untersuchen. Das Trikulturmodell repräsentiert hierbei ein frühes Melanomstadium. Fibroblasten bildeten ein Kollagen IV-reiches Zentrum im Trikultursphäroid, wohingegen Keratinozyten sich zu einem Ring um dieses Zentrum ansammelten und Melanomzellen sich zu proliferierenden Clustern an der Außenseite anordneten. Einige Melanomzellen wurden auch regelmäßig im Fibroblastenkern beobachtet. In Abwesenheit der Melanomzellen stratifizierten die Keratinozyten zu einem inneren basalähnlichen Ring und stärker differenzierten Zellen an der Peripherie. Dagegen reduzierte die Zugabe von Melanomzellen deutlich die Differenzierung der Keratinozyten. Die Behandlung mit dem Zytostatikum Docetaxel stellte diese Differenzierung der Keratinozyten wieder her und induzierte Apoptose in den externen Melanomzellclustern. Darüber hinaus erhöhte die Docetaxelbehandlung erheblich den Umfang der Immunreaktivität auf das Transporterprotein ABCB5 in den verbliebenen, unbeschädigten, externen Melanomzellen. Zusammenfassend wurde ein neuartiges, einfaches, sphäroidbasiertes Melanomtrikulturmodell beschrieben, welches aus Fibroblasten, Keratinozyten und Melanomzellen besteht. Dieses kann nun zur Entwicklung neuer Wirkstoffe und zur Analyse der zelltypspezifischen Wirkungsweise verwendet werden.