German Title: MYCN-Abhängigkeit von MYCN amplifizierten Neuroblastomzelllinien untersucht in Bezug auf ihre Interaktion mit BET Proteinen und in einem neuen orthotopen Mausmodell

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Abstract

Neuroblastomas are the most common extracranial solid tumors in early childhood and account for 7% of all pediatric cancers. Amplification of the MYCN gene occurs in 20-30% of neuroblastoma cases and is associated with aggressive cancers and a poor outcome for the patients. Despite decades of research on MYCN and c-MYC and several known functions of these proteins, there are no therapeutic approaches targeting transcription factors of the MYC family. BET inhibitors inhibit growth and induce apoptosis in several MYC-overexpressing cancer types. Based on these findings, BET inhibitors were tested as part of this thesis for MYCN amplified neuroblastoma in vitro and in vivo. A panel of 23 neuroblastoma cell lines was screened for sensitivity upon treatment with the BET inhibitor JQ1 by using viability assays, soft agar assays and FACS live/dead and cell cycle staining. Based on the viability screening, 55% of the MYCN amplified and 30% of the MYCN non-amplified cell lines were categorized as JQ1 sensitive. Reduced viability was mirrored by the absence of anchorage independent growth and an increase of G1 and sub-G1 fraction after JQ1 treatment. Protein expression data were estimated by western blot and Reverse Phase Protein Array, showing that MYCN protein levels were reduced in 70% of the MYCN amplified neuroblastoma cell lines and that further proteins related to the G1/S-transition of the cell cycle were lower expressed. A shRNA-mediated BRD4 knockdown in MYCN amplified IMR5/75 cells did not affect MYCN protein levels but reduced the expression of Cyclin D1. Global mRNA expression of four JQ1-treated cell lines was analyzed by RNA-sequencing, showing differential expression of genes related to cell cycle, damage response and chromatin methylation. In vivo, treatment with the BET inhibitor BAY1238097 prolonged the survival of mice harboring xenograft tumors deriving from the neuroblastoma cell line LS. Common neuroblastoma mouse models either belong to the MYCN amplified or to the MYCN non-amplified group of neuroblastoma. No neuroblastoma mouse model is available harboring both a strong and a low MYCN gene expression, allowing the analysis of MYCN on and MYCN off conditions with the same genetic background. A MYCN high/low orthotopic neuroblastoma mouse model was established with a tumor growth rate of 80%. Tumor imaging was performed by Magnet-Resonance-Imaging and in vivo bioluminescence. The MYCN knockdown was analyzed and falcified by quantitative PCR and RNA-sequencing. In conclusion, BET inhibitors are probably an efficient therapeutic option for a genetically preselected number of neuroblastoma cases, although amplified MYCN alone is not predisposing neuroblastoma tumors for a therapy with BET inhibitors. The MYCN high/low mouse model needs further research for the establishment of a stable MYCN knockdown.

Translation of abstract (German)

Das Neuroblastom ist mit 7 % aller pädiatrischen Krebserkrankungen der häufigste extrakraniale solide Tumor bei Neugeborenen und Kleinkindern. Eine Amplifikation des MYCN Gens liegt in 20-30 % der Fälle vor und ist mit aggressiven Verläufen assoziiert. Obwohl MYCN und c-MYC seit Jahrzehnten im Fokus der onkologischen Forschung stehen und eine Vielzahl an Funktionen bekannt sind, gibt es bislang noch keine auf MYC ausgerichtete Therapie. Inhibitoren für BET Proteine reduzieren die Proliferation und induzieren Apoptose in einer Vielzahl von MYC-überexprimierenden Tumorentitäten. Basierend hierauf wurden BET Inhibitoren im Rahmen einer präklinischen Studie für MYCN amplifizierte Neuroblastome in vitro und in vivo getestet. Eine Gruppe von 23 Neuroblastomzelllinien wurde mit dem BET Inhibitor JQ1 behandelt und hinsichtlich ihrer Sensitivität untersucht. Hiervon wurden 55 % der MYCN amplifizierten und 30 % der Zelllinien ohne MYCN Amplifikation als sensitiv gegenüber JQ1 eingeordnet. Bei FACS-Analysen wurde ein Anstieg der G1 und sub-G1 Fraktionen beobachtet. Die Proteinexpression wurde mittels Westernblot und Proteinarrays (RPPA) analysiert, hierbei zeigte sich durch die Behandlung mit JQ1 eine Reduktion der MYCN-Proteinexpression in 70 % der MYCN amplifizierten Zelllinien. Des Weiteren konnten Effekte auf weitere zellzyklusrelevante Proteine, insbesondere für den G1/S-Übergang, nachgewiesen werden. Eine durch shRNA vermittelte Reduktion von BRD4 zeigte keine Auswirkungen auf die MYCN Proteinexpression von IMR5/75 Zellen, verringerte jedoch die Cyclin D1 Expression. Umfangreiche Genexpressionsanalysen von vier mit JQ1 behandelten Zelllinien zeigten Veränderungen in der Expression von Genen, die mit dem Zellzyklus, Methylierung des Chromatins oder Schäden an der DNA in Verbindung stehen. In vivo verlängerte eine Therapie mit dem BET Inhibitor BAY1238097 das Überleben von Mäusen mit Tumoren, die von der Neuroblastomzelllinie LS abstammten. Standardmäßig genutzte Mausmodelle des Neuroblastoms gehören entweder zu den MYCN amplifizierten oder den nicht-amplifizierten Neuroblastomen. Es existieren keine Mausmodelle, die vor dem identischen genetischen Hintergrund alternativ eine starke oder schwache MYCN Expression zeigen. Im Rahmen der Arbeit wurde ein solches orthotopes Mausmodell etabliert. Als bildgebende Verfahren wurden Magnetresonanztomografie und in vivo Biolumineszenz eingesetzt. Eine Reduktion der MYCN Expression in den Tumoren konnte mittels quantitativer PCR und RNA-Sequenzierung nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend sind BET Inhibitoren eine Option für die Therapie einer vorselektierten Gruppe von Neuroblastomen. Eine Auswahl potentiell geeigneter Patienten muss neben einer MYCN-Amplifikation auf weiteren Faktoren beruhen. Um im Mausmodell stabil eine erniedrigte MYCN-Expression zu erreichen sind weitere Versuche erforderlich.