German Title: Erforschung des Nutzens eines NRPS, das ein blaues Pigment herstellt, als Markierungsmethode für maßgeschneiderte NRPs

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Abstract

Nonribosomal peptide synthetases (NRPSs) are modular mega-enzymes found in bacteria and fungi that produce nonribosomal peptides (NRPs) in an assembly line fashion. Each module is in charge of adding a specific amino acid (AA) to the growing peptide chain. Three basic domains constitute one NRPS module: the adenylation (A), peptidyl carrier protein (PCP) and condensation (C) domains. The A domain recognizes and activates the AA. An external enzyme, the PPtase, attaches a phosphopantetheine (PPant) arm to the PCP domain which then picks up the activated AA and delivers it to the C domain. The C domain recognizes the growing peptide chain (donor) as well as the new AA (acceptor) and fuses the two together. A special feature of NRPSs is their ability to recognize and incorporate not only proteinogenic AAs, but also other building blocks like fatty acids (FAs) or non-proteinogenic AAs. All building blocks can be further modified through the action of additional domains: epimerization (E), methylation (M) and oxidation (Ox) domains, among others. In this manner a great variety of different NRPs can be synthesized, many of which are bioactive and exhibit anti-microbial or anti-cancer properties. Thus, it is highly desirable to understand how NRPS domains and modules function and find ways to genetically re-engineer them for custom NRP production. Since the discovery of NRPSs, many efforts have already been made to engineer these enzymes in order to create custom NRPs, but general design rules yet remain elusive. The successful attempts to re-create functional NRPS for the production of novel NRPs include: (i) mutations of the A domain, (ii) subdomain modifications and (iii) rearrangements on the module level. Yet, many engineered NRPSs exhibit only slow reaction rates and low product yields. In some cases, the desired NRP products cannot be detected at all, possibly due to additional control mechanisms that have not been taken into account during the engineering process, such as substrate specificity of C domains. Hence there is still a great need to identify the general rules for successful NRPS engineering in order to exploit the ever-growing molecular toolbox of newly discovered NRPSs for recombinant production of novel bioactive compounds. In this work I present my attempts to develop an approach to easily monitor the outcome of NRPS manipulation using a pigment-producing synthetase as a genetic tag. To this end, I first investigated two homologous synthetases, IndC and BpsA, which produce the blue pigment indigoidine, and mutants thereof and revised the proposed biosynthesis mechanism. I then created a series of fusion constructs between modules coming from different NRPSs and IndC/BpsA to test if indigoidine-tagged peptides could be produced. I identified a promising construct for which point mutations in the upstream module resulted in weaker or null pigment production. However, the expected indigoidine-tagged AA was not detectable, which could be due to the fact that indigoidine production inevitably leads to the separation of the donor AA. These results raised further questions as to whether in a native NRPS, the same modifications lead to congruent effects in neighboring modules. I addressed this question using a fragment of a non-engineered NRPS to monitor the activity of the native and modified versions in an in vitro assay, which I present in the last part of the results. Surprisingly, the effects of the same set of modifications on neighboring modules did not only differ between the engineered NRP-pigment synthetase and the native NRPS, but also between different modules within the native NRPS. These results hint at highly individual behavior of NRPS modules, depending on the context they are in.

Translation of abstract (German)

Nichtribosomale Peptidsynthetasen (NRPSs) sind modulare Megaenzyme, die in Bakterien und Pilzen vorkommen und nichtribosomale Peptide (NRPs) in Fließband-Art produzieren. Jedes Modul ist dafür verantwortlich, der wachsenden Peptidkette eine spezifische Aminosäure (AA) hinzuzufügen. Drei grundlegende Domänen bilden ein NRPS-Modul: die Adenylierungs- (A-), Peptidyl-Carrier-Protein- (PCP-) und Kondensations- (C-)Domänen. Die A-Domäne erkennt und aktiviert die AA. Ein externes Enzym, die PPtase, bindet einen Phosphopantethein-Arm (PPant) an die PCP-Domäne, der dann die aktivierte AA aufnimmt und an die C-Domäne weiterleitet. Die C-Domäne erkennt die wachsende Peptidkette (Donor) sowie die neuen AA (Akzeptor) und verbindet die beiden miteinander. Das Besondere an NRPSs ist ihre Fähigkeit, nicht nur proteinogene AAs zu erkennen und einzubauen, sondern auch andere Bausteine wie Fettsäuren (FA) oder nicht-proteinogene AAs. Alle Bausteine können durch zusätzliche Domänen weiter modifiziert werden: dazu gehören die Epimerisierungs- (E-), Methylierungs- (M-) und Oxidations- (Ox-)Domänen. Auf diese Weise kann eine große Vielfalt verschiedener NRPs synthetisiert werden, von denen viele bioaktiv sind und antimikrobielle oder tumorunterdrückende Eigenschaften haben. Daher ist es äußerst wünschenswert, die Funktionsweise von NRPS Domänen und Modulen zu verstehen und Wege zu finden, um sie genetisch für die benutzerdefinierte NRP-Produktion neu zu konstruieren. Seit der Entdeckung von NRPSs wurden bereits viele Anstrengungen unternommen, um diese Enzyme zu rekonstruieren, um benutzerdefinierte NRPs herzustellen, aber allgemeine Regeln dafür sind immer noch schwer aufzustellen. Experimentelle Ansätze funktionelle NRPSs für die Herstellung neuartiger NRPs zu rekonstruieren umfassen: (i) Mutationen der A-Domäne, (ii) Modifikationen von Subdomänen und (iii) Neuanordnungen ganzer Module. Viele neu angeordnete NRPSs weisen jedoch niedrige Reaktionsgeschwindigkeiten und geringe Produktausbeuten auf. In einigen Fällen konnte das gewünschte Produkt überhaupt nicht nachgewiesen werden, was möglicherweise auf zusätzliche Kontrollmechanismen, z.B. durch die C-domäne, zurückzuführen ist und bei der Neukonstruktion der NRPSs nicht berücksichtigt wurde. Es besteht daher nach wie vor ein großer Bedarf, die allgemeinen Regeln für ein erfolgreiches NRPS-Engineering zu ermitteln, um die ständig wachsende molekulare Toolbox neu entdeckter NRPS für die rekombinante Produktion neuartiger bioaktiver Verbindungen zu nutzen. In dieser Arbeit zeige ich Ansätze zur Entwicklung einer Methode zur einfachen Evaluierung des Effekts von NRPS Manipulationen auf deren Aktivität anhand der Bildung eines farbigen Produkts durch eine genetisch an das modifizierte NRPS angehängten Pigmentsynthetase. Zu diesem Zweck untersuchte ich zwei homologe Synthetasen, IndC und BpsA, die das blaue Pigment Indigoidin produzieren. Die Analyse verschiedener Mutanten dieser Synthetasen führten zu der Überarbeitung des bisher anerkannten Biosynthesemechanismus. Anschließend erstellte ich eine Reihe von Fusionsenzyme aus Modulen verschiedener NRPSs und IndC/BpsA, um zu testen, ob mit Indigoidin markierte Peptide hergestellt werden. Eines der Fusionsenzyme war vielversprechend, da Punktmutationen im Upstream-Modul zu einer abgeschwächten oder gar keiner Pigmentproduktion führten. Jedoch ließ sich die erwartete mit Indigoidin markierte AA nicht nachweisen, was darauf zurückzuführen sein könnte, dass die Indigoidinproduktion zwangsläufig zur Abspaltung der Donor-AA führt. Diese Ergebnisse warfen weitere Fragen auf, z.B. ob in einem natürlichen NRPS die gleichen Mutationen zu den gleichen Effekten in benachbarten Modulen führen. Um diese Frage zu beantworten, habe ich drei natürlich zusammenhängende Module eines NRPS in vitro untersucht. Dabei habe ich herausgefunden, dass sich die Auswirkungen der gleichen Modifikationen auf benachbarte Module nicht nur zwischen dem konstruierten NRP-Pigment Fusionsenzym und dem natürlich zusammenhängenden NRPS, sondern auch zwischen verschiedenen Modulen innerhalb des natürlichen NRPS, unterscheiden. Diese Ergebnisse deuten auf ein sehr individuelles Verhalten von NRPS-Modulen hin, je nachdem, in welchem Kontext sie sich befinden.