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Abstract

Human malaria is caused by protozoan parasites of the genus Plasmodium and is a major contributor to global morbidity and mortality. Plasmodium falciparum is the most virulent of five Plasmodium species that infect human. As in the other species, P. falciparum develops and proliferates in the nutrient-rich anucleated erythrocyte, consuming glucose for energy and metabolizing haemoglobin as a source of amino acids. In the erythrocyte, the parasite is also able to avoid some of the host’s immune responses during infection. To support the high growth rate of the parasite during infection, glucose consumption in the infected erythrocytes increases by up to 75-fold in comparison with uninfected erythrocytes. As a consequence, a high amount of the 2-oxoaldehyde methylglyoxal, a toxic by-product of glycolysis, is spontaneously formed in the parasite. Methylglyoxal reacts with and damages nucleic acids and proteins leading to the formation of the so-called advanced glycation end-products (AGE) in the cell. Glyoxalases 1 and 2 (Glo1 and Glo2) of the ubiquitous glyoxalase system catalyze the glutathione-dependent detoxification of methylglyoxal and other 2-oxoaldehydes to non-toxic 2-hydroxycarboxylic acids. In the P. falciparum infected erythrocyte, two functional glyoxalase systems operate; one in the cytosol of the erythrocyte (hGlo1 and hGlo2) and the other in the parasite cytosol (PfGlo1 and PfcGlo2). In addition to the cytosolic enzymes, P. falciparum also encodes a functional apicoplast-targeted Glo2 enzyme (PftGlo2), and an inactive Glo1-like protein (PfGILP) that also carries an apicoplast-targeting sequence. On account of the detoxification role the glyoxalase system plays during Plasmodium infection, there has been a long-standing hypothesis that inhibition or knockout of the Plasmodium glyoxalase-encoding genes would lead to an accumulation of methylglyoxal (2-oxoaldehydes) in the host-parasite unit and result in parasite death. And so, the glyoxalase system(s) of the host-parasite unit could be targeted for antimalarial drug development. This thesis investigated the relevance of the glyoxalase system to the blood-stage parasite survival by generating clonal PFGLO1 and PFcGLO2 knockout lines of P. falciparum 3D7 strain using the CRISPR-Cas9 system. SYBR green-based growth assays of the knockout clones showed that the 3D7Δglo1 knockout clones had an increased susceptibility to the external 2-oxoaldehyde glyoxal compared with the 3D7Δcglo2 knockout clone and the 3D7 wild-type strain. Western blot analyses also supported the accumulation of selected modified proteins in 3D7Δglo1 and 3D7Δcglo2 knockout strains in comparison with the 3D7 wild-type strain. The 3D7Δglo1 and 3D7Δcglo2 knockout lines were, however, viable and showed no significant morphological or growth phenotype under standard growth conditions. Furthermore, the lack of PfcGlo2, but not PfGlo1, resulted in increased gametocyte induction and gametocytogenesis in the knockout lines. PfGlo1 and PfcGlo2 are therefore dispensable during asexual blood-stage development and the loss of PfcGlo2 may actually contribute to the transmission of the malaria parasite. The results show that PfGlo1 and PfcGlo2 are non-essential and most likely not suitable for targeted antimalarial drug development. Several attempts to generate knockout clonal lines for the apicoplast targeted glyoxalase enzymes were unsuccessful. Transfectants resistant to both positive and negative selection were obtained in three knockout trials but were all confirmed to be false-positive transgenic parasites. The most probable explanation for this outcome is an off-target or unwanted integration of the positive selectable marker into the parasite genome. Methodological limitations, rather than the essentiality of the two enzymes, are therefore most likely the cause of the negative knockout results. The thesis also investigated the relevance of the hGlo1 enzyme to the survival of the parasite in the host-parasite unit using three tight-binding Glo1 inhibitors. Inhibitor treatments of uninfected erythrocytes showed an extremely slow inactivation of the host cell glyoxalase. Esterification did not confer improved pharmacokinetics nor increased the potency of the inhibitors. Inhibition of the erythrocyte Glo1 enzyme did not affect parasite development in the host cell, pointing to a potential dispensability of the host cell enzyme for parasite survival in the host-parasite unit. Finally, as a way of addressing the relevance of the so-called oxidative stress on parasite development, the thesis investigated the effects of the prooxidant H2O2 and the so-called antioxidants NAc, ascorbate, and DTT on the survival of P. falciparum 3D7 strain. IC50 values for the redox agents were determined for ring-stage synchronized parasites using a SYBR green-based growth assay. An IC50 value of 78 mM for H2O2 revealed the compound as a very poor prooxidant in parasite culture. The host-parasite unit appears to be very robust against challenges with H2O2 and parasite killing required extremely high concentrations with implications for host defence mechanisms. The reductants NAc, ascorbate and DTT also had antiproliferative instead of growth-promoting effects with IC50 values around 16, 4 and 0.3 mM, respectively. Taken together, the host-parasite unit appears more tolerant to high levels of H2O2, ascorbate and NAc, but is more susceptible to DTT. The inhibitory effect of the so-called antioxidants has implications for clinical trials and studies on oxidative stress.

Translation of abstract (German)

Menschliche Malaria wird von Protozoenparasiten der Gattung Plasmodium verursacht und gehört zu den Hauptursachen der globalen Morbidität und Sterblichkeit. Plasmodium falciparum ist der virulenteste der fünf humanpathogenen Malaria-Arten. Wie auch die anderen Arten, entwickelt und vermehrt P. falciparum sich in nährstoffreichen zellkernlosen Erythrozyten, nutzt Glucose als Energiequelle und metabolisiert Hämoglobin als Aminosäurequelle. Innerhalb der roten Blutkörperchen ist der Parasit teilweise auch in der Lage, sich der Immunantwort des Wirts während der Infektion zu entziehen. Als Folge der hohen Wachstumsrate des Parasiten während der Infektion erhöht sich der Glucoseverbrauch des infizierten Erythrozyten um das bis zu 75-fache im Vergleich zu nicht infizierten Erythrozyten. Als eine Konsequenz entsteht spontan eine große Menge des 2-Oxoaldehyds Methylglyoxal als toxisches Nebenprodukt der Glykolyse im Parasiten. Glyoxalase 1 und 2 (Glo1 und Glo2) des ubiquitären Glyoxalase Systems katalisieren die glutathionabhängige Entgiftung von Methylglyoxal und anderen 2-Oxoaldehyden zu ungiftigen 2-Hydroxycarbonsäuren. In mit P. falciparum infizierten Erythrozyten sind zwei funktionale Glyoxalase-Systeme tätig; eins im Zytosol des Erythrozyten (hGlo1 und hGlo2) und das andere im Zytosol des Parasiten (PfGlo1 und PfcGlo2). Zusätzlich zu den zytosolischen Enzymen, codiert P. falciparum für das funktionelle Glo2 Enzym (PftGlo2) mit Apicoplast-Zielsequenz und ein inaktives Glo1-ähnliches Protein (PfGILP), welches auch eine Apicoplast-Zielsequenz aufweist. Aufgrund der Entgiftungsrolle des Glyoxalase-Systems während einer Plasmodien-Infektion, gibt es seit langer Zeit die Hypothese, dass eine Inhibition oder das Ausschalten der Glyoxalasen in Plasmodium zu einer Anreicherung von 2-Oxoaldehyden in der Wirt-Parasiten-Einheit führen könnte, welche zum Tod des Parasiten führen könnte. Deshalb könnte das Glyoxalase-System der Wirt-Parasiten-Einheit ein mögliches Angriffsziel für die Entwicklung von Antimalariawirkstoffen sein. In dieser Arbeit wurde die Relevanz des Glyoxalase-Systems für das Überleben des Parasiten in Blutzellstadien untersucht, indem klonale P. falciparum 3D7 Knockout Stämme für PFGLO1 und PFcGLO2 mithilfe der CRISPR-Cas9 Technologie erzeugt wurden. Auf SYBR-green basierte Wachstumsstudien der Knockout Klone zeigten, dass die 3D7Δglo1 Knockout Klone eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber externem Glyoxal im Vergleich zu den 3D7Δcglo2 Knockout Klonen und Wildtypparasiten zeigten.Western Blot Untersuchungen zeigten ebenfalls eine Anreicherung von ausgewählten modifizierten Proteinen in den 3D7Δglo1 and 3D7Δcglo2 Knockout Stämmen im Vergleich zum 3D7 Wildtypstamm. Allerdings waren alle klonalen Linien des 3D7Δglo1 und 3D7Δcglo2 Knockouts überlebensfähig und zeigten keinen signifikanten morphologischen oder Wachstums-Phänotyp unter Standardwachstumsbedingungen. Außerdem resultierte das Fehlen von PfcGlo2, aber nicht das Fehlen von PfGlo1, überraschenderweise in einer erhöhten Gametozytenbildung in den Knockout-Stämmen. PfGlo1 und PfcGlo2 sind daher entbehrlich während der asexuellen Blutstadienentwicklung und der Verlust von PfcGlo2 könnte tatsächlich zur Übertragung des Malariaparasiten beitragen. Die Daten zeigen, dass PfGlo1 und PfcGlo2 nicht essentiell und daher höchstwahrscheinlich nicht für die zielgerichtete Entwicklung eines Malariamedikaments geeignet sind. Mehrere Versuche klonale Knockout-Stämme für die Glyoxalasen des Apicoplasten zu generieren waren erfolglos. Transfektanten, welche sowohl gegen positive als auch negative Selektion resistent waren, wurden in drei Knockout-Versuchen erzielt, wurden aber alle als falsch positive transgene Parasiten identifiziert. Die wahrscheinlichste Erklärung für dieses Ergebnis sind unerwünschte Integrationen des positiven Selektionsmarkers in das Genom des Parasiten. Methodische Einschränkungen sind daher plausibler als Erklärung der negativen Knockout Ergebnisse als dass die zwei Enzyme essentiell sind. In diesem Projekt wurde außerdem die Relevanz des hGlo1 Enzyms auf das Überleben des Parasiten in der Wirt-Parsiten-Einheit untersucht, indem zwei Inhibitoren der Glyoxalase Glo1 und deren Carboxyl tert-butyl Ester Derivate eingesetzt wurden. Die Behandlung nicht-infizierter Erythrozyten mit Inhibitor zeigte eine extrem langsame Inaktivierung der Wirtszellglyoxalase. Eine Veresterung führte weder zu verbesserter Pharmocokinetik noch erhöhte sich die Wirksamkeit des Inhibitors. Die Inhibition des Glo1-Enzyms des Erythrozyten hatte keinen Effekt auf die Entwicklung des Parasiten was auf eine mögliche Entbehrlichkeit des Wirtsenzyms für das Überleben des Parasiten in der Wirt-Parasiten-Einheit deutet. Schließlich wurde in dieser Arbeit der Effekt des Prooxidants H2O2 und der sogenannten Antioxidantien NAc, Ascorbat und DTT auf das Überleben des 3D7-Stamms von P. falciparum untersucht, um Einblicke in die Relevanz von sogenanntem oxidativem Stress auf die Entwicklung des Parasiten zu gewinnen. Für die Redoxmittel wurden IC50-Werte mit synchronisierten Parasiten im Ringstadium mittels SYBR-green basierten Wachstumskurven bestimmt. Ein IC50-Wert von 78 mM für H2O2 zeigte, dass H2O2 ein sehr schwaches Prooxidants in der Parasitenkultur ist. Die Einheit aus Wirt und Parasit scheint sehr widerstandsfähig gegen die Behandlung mit H2O2 zu sein, und um den Parasiten zu töten waren extrem hohe Konzentrationen nötig, die auch Auswirkungen auf den Verteidigungsmechanismus des Wirts haben. Die Reduktionsmittel NAc, Ascorbat und DTT hatten auch einen antiproliferativen anstatt wachstumsfördernden Effekt mit entsprechenden IC50-Werten von 12, 3 und 0,4 mM. Zusammengefasst scheint die Einheit aus Wirt und Parasit toleranter gegen hohe Konzentrationen von H2O2, Ascorbat und NAc zu sein, aber anfälliger für DTT. Der hemmende Effekt der sogenannten Antioxidantien hat Auswirkungen für klinische Versuche und Studien zum oxidativen Stress.