German Title: Modellierung und Simulation von Membranproteinen zum Verständnis ihrer Struktur, Dynamik und Funktion

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Abstract

Human cytochrome P450 (CYP) enzymes play an important role in the metabolism of drugs, steroids, fatty acids and xenobiotics. CYPs also catalyze the conversion of some pro-drugs into active drugs. Only about a dozen human CYPs metabolize 70-80% of all drugs. A subset of CYPs is responsible for steroidogenesis, of these CYP17 is a major drug target for prostate cancer therapy. Human CYPs are anchored to the endoplasmic reticulum membrane by their N-terminal transmembrane (TM) helix. However, most crystal structures of CYPs have been resolved after truncating the TM-helix or mutating residues that form contacts with the membrane. Therefore, the structural basis for CYP-membrane interactions and orientation, and the mechanism of substrate entrance into the buried binding pocket and product release is not clearly understood. In order to understand the interactions and orientations of CYPs and their degree of penetration into the membrane, I have optimized a multiscale modeling protocol that involves coarse-grained and all-atom molecular dynamics simulations. The protocol was validated by applying it to several drug-metabolizing CYPs (CYP1A1, 1A2, 2C9, 2C19, 3A4) and CYPs involved in steroidogenesis (CYP17, CYP19) in a lipid bilayer. The simulations revealed that the sequence and structural differences in the protein-membrane interface alter the interactions and orientations of CYPs in the membrane. Furthermore, mutations in the TM-helix of CYP17, particularly W2A and E3L, were seen to disrupt the CYP-membrane interactions and in some cases, obstruct the ligand tunnels between the active site and the membrane, which could lower enzyme turnover. In conclusion, the optimized multiscale simulation protocol has been used to identify different interactions and orientations adopted by the globular domains of CYPs with the membrane that have implications for CYP function. This protocol is also suitable for studying protein-protein-membrane complexes and proteins in membranes with different lipid compositions.

Translation of abstract (German)

Humane Cytochrom P450 (CYP) Enzyme spielen eine wichtige Rolle bei der Verstoffwechselung von Steroiden, Fettsäuren, Arzneistoffen und anderen Xenobiotika. Ca. 70-80% aller Arzneistoffe werden durch die CYP450 Familie umgesetzt inkl. der Umwandlung von Prodrugs in aktive Wirkstoffe. Die Enzymfamilie dient zudem als Zielstruktur einiger Therapieansätze, z. B. das für die Steroidogenese wichtige CYP17 bei der Bekämpfung von Prostatakrebs. Humane CYPs sind durch eine N-terminale Transmembran (TM)-Helix mit der Membran des Endoplasmatischen Retikulums assoziiert. Kristallstrukturen der CYP Enzyme wurden meist jedoch nur für CYPs ohne TM-Helix oder mit eingeführten Punktmutationen an den Protein-Membran Kontaktstellen gelöst. Aus diesem Grund ist die strukturelle Basis der CYP-Membran-Interaktionen und der Mechanismus des Substratein- und austritts in die versteckte Bindetasche nur unzureichend beschrieben. Um die Interaktionen und Orientierungen von CYPs in der Membran zu verstehen, beschreibe ich hier die Optimierung eines multiskalaren Modellierungsprotokolls, das „course-grained“ und „all-atom“ Molekulardynamik Simulationen nutzt. Das Protokoll wurde anhand von mehreren, funktionell variierenden CYPs validiert, inkl. CYP1A1, 1A2, 2C9, 2C19 und 3A4 für die Verstoffwechselung von Arzneistoffen und die an der Steroidogenese beteiligten Enzyme CYP17 und CYP19. Die multiskalaren Simulationen zeigten, dass strukturelle und Sequenzunterschiede an der Protein-Membran Schnittstelle die Interaktionen und Orientierungen der globulären CYP-Domänen in der Membran verändern. Zudem behinderten Mutationen in der TM-Helix von CYP17 (insbesondere W2A und E3L) die Ausbildung der Interaktionen und führten in einigen Fällen zur partiellen Blockade des Liganden-Tunnels zwischen der Membran und dem aktiven Zentrum. Aus diesem Grund könnten sich diese Punktmutationen negativ auf den enzymatischen Substratumsatz auswirken. Zusammenfassend wurden mit der Anwendung des optimierten multiskalaren Modellierungsprotokolls Interaktionen und Orientierungen der globulären CYP-Domänen in der Membran identifiziert, die für die Funktionsweise der Enzyme von Bedeutung sein könnten. Verallgemeinert bietet das Protokoll zudem Möglichkeiten der Untersuchung von Protein-Protein-Membran Komplexen und von Proteinen in Membranen mit variierenden Lipidzusammensetzungen.