German Title: Chemorezeption im Seeringelwurm Platynereis dumerilii : Anatomie, Physiologie, Verhalten

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Abstract

Chemical stimuli are omnipresent in driving all kinds of animal behaviours. The comparative study of chemosensory systems has revealed a wide variety of organs, neuronal circuits, and above all of receptor proteins. Despite some conserved features, no clear picture has emerged yet about the origins of chemoreception, and new animal models are needed to understand its evolutionary history.

The marine worm Platynereis dumerilii (Nereididae, Polychaeta, Annelida, Lophotrochozoa) is a model system for evolutionary developmental biology, and recent achievements have revealed its potential for neurobiology. The head of marine annelids is generally equipped with abundant sensory appendages, chemosensory based on numerous morphological descriptions. Surprising as it may seem for this ecologically important phylum, there exists still no direct physiological proof of chemosensitivity in these prominent organs. Moreover, in the absence of appropriate assay systems, physiological experiments in Platynereis have so far concentrated on photic and mechanical stimuli.

The aim of this thesis was the description and physiological study of chemosensory systems in Platynereis, as well as the establishment of microfluidics-based methods to enable functional imaging and behavioural assays upon chemical stimulations. The 6-days-post-fertilisation larval stage (6dpf), at which most adult anatomical structures are already present, has emerged as a powerful stage for cross-species comparisons of cell types, thanks notably to a unique whole-body atlas of gene expression. It was thus chosen as a target stage for the study of chemosensation.

An anatomical investigation of Platynereis head appendages at various stages has allowed to better understand how the hemispheric head of larvae transforms into the complex, appendage-rich head of juveniles and adults. Neuroanatomical stainings have confirmed the presence already at 6dpf of different architectures, innervation patterns, and sensory cell types across appendages. A reference anatomical description has been established at 6dpf to characterise the position of nerves and sensory ganglia, which constitutes a useful basis for in vivo studies.

After having developed a microfluidic setup for confocal calcium imaging of the whole head upon chemical stimulations, I have tested the physiology of candidate chemosensory organs in 6dpf animals. These experiments have revealed that antennae, not nuchal organs as thought previously, are probably the main chemosensory organ in Platynereis, that nuchal organs and palps are endowed with chemosensitivity, and that so are tentacular cirri though to a lesser extent. Prominent fluctuating apical organ activity was seen, though not obviously related to chemosensation. Finally, new components of the chemosensory systems have been described based on their activity patterns, including sensory cells and probably interneurons. Based on these results, a first understanding of chemical stimulus detection has emerged. Partial evidence was given that Mushroom Bodies may play a role in these systems at 6dpf, which motivates the study of associative learning in relation with chemical cues.

To link chemical stimuli to larval behaviours, additional microfluidic devices have been developed in which freely-moving larvae can be exposed to controlled spatial and temporal patterns of chemical stimuli and their behaviour monitored. In the perspective of establishing an assay for chemosensory associative learning, aversive compounds such as quinine have been tested and found to produce stereotypical avoidance behavioural responses, thus they could be used as unconditioned stimuli in pavlovian assays. A neutral cue identified in functional imaging, 1-butanol, was shown to be a valid candidate as a conditioned stimulus. Thanks to these preliminary results, an experimental setup for quantitative studies of behavioural modifications is now available.

Overall, this work has laid a basis for the study of chemosensation in Platynereis, informed about sensory organ physiology in polychaetes, and shown the suitability of microfluidic setups for physiological and behavioural assays at larval stages. It suggests a possibly broad chemosensory repertoire in marine invertebrate larvae. Chemical stimuli in annelids are worth new attention for comparative studies of sensory systems, and in the search for associative learning abilities.

Translation of abstract (German)

Die Perzeption von chemischen Stimuli ist die Grundlage für eine Vielzahl an tierischen Verhaltensweisen. Durch den Vergleich von chemosensorischen Systemen wurde eine große Vielfalt von Organen, neuronalen Schaltkreisen und vor allem von Rezeptoren entdeckt. Obwohl eine Vielfalt an Mechanismen konserviert ist, ist es bis jetzt unklar wie sich die Chemorezeption im Laufe der Evolution entwickelt hat. Neue Modellorganismen sind nötigt, um diese Entwicklung besser nachvollzuziehen zu können.

Der Borstenwurm Platynereis dumerilii (Nereididae, Polychaeta, Annelida, Lophotrochozoa) ist ein Modellorganismus in der evolutionären Entwicklungsbiologie und Neurobiologie. Im Allgemeinen ist der Kopf von Seeanneliden mit vielen Sinnesorganen augestattet, die laut anatomischen Studien als chemosensorisch betrachtet werden. So überraschend es klingen mag, für diesen aus ökologischen Sicht wichtigen Stamm ist die Chemosensitivität von diesen prominenten Organen noch durch keine physiologische Befunden gestützt. Da bisher keine geeignete Versuchsmethode vorhanden war, wurde durch physiologische Experimente vor allem die Reaktion auf Lichtreize und mechanische Stimuli untersucht.

Das Ziel dieser Doktorarbeit ist die anatomische Beschreibung und physiologische Charakterisierung von chemosensorischen Systemen in Platynereis, sowie die Etablierung von Mikrofluidik basierenden Methoden zur funktionellen Bildgebung von chemischen Stimulierungen bei Verhaltensexperimente. Die 6 Tage alten Larve (6dpf, days-post-fertilization) wurde hierfür gewählt, da die meisten anatomischen Strukturen der adulten Tiere schon ausgebildet sind und für dieses Stadium zudem ein Genexpressionsatlas erstellt wurde, der den Vergleich von Zelltypendentitäten zwischen Spezies auf der molekularen Ebene ermöglicht.

Die schrittweise Umwandlung des runden larvalen Kopfes in den komplexen Kopf der adulten Tiere wurde durch anatomische Studien der Sinnesorganen von Platynereis in verschiedenen Entwicklungsstufen dokumentiert. Neuroanatomische Färbungen der Sinnesorgane der 6 Tage alten Larve haben die Präsenz von verschiedenen Organarchitekturen, Innervationsweise und Sinneszelltypen aufgedeckt. Außerdem wurde für die 6 Tage alte Larve eine anatomische Beschreibung der Lage von Nerven und sensorischen Ganglien gegeben, die Grundlage für folgende in vivo Studien darstellt.

Nachdem ich eine neue Mikrofluidik-basierte Methode für kopfweite Calcium-Bildgebung durch Konfokalmikroskopie aufgestellt hatte, habe ich die Physiologie der mutmaßlich chemosensorischen Organe in der 6 Tage alten Larve getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Antennen, und nicht die Nuchalorgane, wahrscheinlich das zentrale chemosensorische Organ von Platynereis sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass die Nuchalorgane und die Palpen tatsächlich chemosensorische Eigenschaften haben, sowie die tentakulären Cirren, wenn auch in geringerem Ausmaß. Eine prominente, fluktuierende Calcium-Aktivität wurde im Apikalorgan beobachtet, jedoch ohne deutliche Verbindung mit den chemischen Stimuli. Des Weiteren wurden neue Elemente des chemosensorischen Systems beschrieben, einschließlich Sinneszellen und Interneurone. Diese Ergebnisse legen die Grundlage für das Verständnis der chemischen Wahrnehmung. Es wurde teilweise nachgewiesen, dass die Pilzkörper (Mushroom Bodies) in diesem chemosensorischen System in der 6 Tage alten Larve involviert sind. Dieses Beobachtung fördert die weitere Untersuchung von assoziativen Lernfähigkeiten im Zusammenhang mit chemischen Stimuli.

Um die Auswirkung von spezifischen chemischen Reizen auf dem larvalen Verhalten zu untersuchen, wurden zusätzliche Mikrofluidik-Plattformen entwickelt, in denen sich die Larven in raum-zeitlich kontrollierten chemiksche Reizen frei bewegen. Bei dem test von Substanzen wie Chinin has sich ergeben, daß diese einen aversiven Reiz auslösen, undzwar sogar mit stereotypischen Vermeidungsverhalten, und daher passende unbedingte Stimuli darstellen in der Perspektive eines Versuchs für assoziatives Lernen. 1-butanol hingegen konnte als neutraler Stimulus identifiziert werden. Dank dieser Ergebnisse ist jetzt ein geeigneter Versuchsaufbau für die quantitative Untersuchung von Verhaltensmodifizierungen von Platynereis etabliert.

Diese Arbeit legt eine Basis für die weitere Studien zur chemosensorischen Perzeption in Platynereis. Sie liefert Informationen über die Physiologie der Sinnesorganen in Polychäten und hat gezeigt, das Mikrofluidik für physiologische und Verhaltensversuche in larvalen Stadien geeignet ist. Zudem deuten die Ergebnisse auf ein breites Verhaltensrepertoire von marinen Invertebratenlarven hin. Die Verarbeitung von chemischen Stimuli in Anneliden sist neuer Aufmerksamkeit würdig, sowohl für die vergleichende Studie von Sinnesystemen als auch für das Verständnis von assoziativen Lernfähigkeiten.