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Abstract

The trans-Golgi network (TGN)/ early endosome (EE) is the main sorting station for proteins travelling along the secretory- or endocytic route. Acidification by the TGN/EE-localised vacuolar-type proton (H+)-ATPase (V-ATPase) is essential for functional protein trafficking as well as compartment structure. Inhibition of this V-ATPase ceases protein trafficking through the TGN/EE and inhibits cell elongation. To sustain TGN/EE functions, luminal pH has to be kept on a homeostatic level. A mechanism to maintain V-ATPase-mediated acidification is to balance the bulk positive charges in the TGN/EE lumen accumulated by H+ pumping via parallel anion import. However, previous measurements of V-ATPase-dependent acidification in the TGN/EE were mainly done in transient expression systems and used sensors suited for rather alkaline pH conditions. Furthermore, TGN/EE-localised anion transporter from the ClC-family which have been proposed to serve in luminal charge balance are largely uncharacterised. For that purpose, in vivo TGN/EE pH measurements using the genetically encoded pH sensor pHusion linked to the TGN/EE resident protein SYP61 were established. We determined that the steady state pH of 5,6 in the TGN/EE in Arabidopsis roots is controlled by the combined activity of the V-ATPase and H+-coupled antiporters. Moreover the role of ClCd and ClCf in supporting the TGN/EElocalised V-ATPase in acidification was investigated. Whereas knock-out of both TGN/EElocalised ClCs caused male gametophyte lethality, we identified via inducible knock-downs an essential role of both transporters in cell elongation. However, neither TGN/EE pH nor TGN/EEmediated trafficking was altered upon reduced reduction of ClCf in the clcd background. Curiously, trans-Golgi pH was more acidic than WT due to a partial mislocalisation of the TGN/EE-localised V-ATPases to the Golgi stack. Finally, a computational modelling approach suggested that ClCd functions as Cl-/H+ antiporter whereas clear predictions on ClCf functions could not been made. We established a method to measure V-ATPase-mediated TGN/EE acidification in vivo in Arabidopsis thaliana. Furthermore, we showed that the TGN/EE is acidified by the V-ATPase and co-determined by TGN/EE-localised transporters. Besides VATPase activity, anion import in the TGN/EE mediated by two ClC members ClCd and ClCf is essential for cell elongation. By that we revealed a previously unknown role of luminal anion homeostasis in the TGN/EE.

Translation of abstract (German)

Das "trans-Golgi network (TGN)/ early endosome (EE)" ist das zentrale Verteiler-Kompartiment für Proteine, die über den sekretorischen und endozytischen Weg transportiert werden. Alle Transportfunktionen des TGN/EEs sowie dessen Struktur, sind abhängig von der Aktivität einer V-Typ H+-ATPase (V-ATPase). Inhibierung dieser Protonenpumpe blockiert alle Proteintransportwege durch das TGN/EE und hemmt, als eine direkte Folge, die Zellelongation. Um eine korrekte Funktion des TGN/EEs zu gewährleisten ist es notwendig, dass der luminale pH Wert des TGN/EEs konstant gehalten wird. Ein Mechanismus hierfür ist ein Ladungsausgleich der positiven H+ Ionen, die durch die V-ATPase zur luminalen Ansäuerung importiert werden, durch parallelen Anionen-Einstrom. Bisherige Messungen der V-ATPaseabhängigen Ansäuerung des TGN/EE Lumens wurden hauptsächlich in transienten Expressionssystemen durchgeführt, unter der Verwendung von pH Sensoren die in alkalischen Bedingungen funktional sind. Darüber hinaus wurden Anionen Transporter aus der ClC-Familie, die als Kandidaten zum Import von Gegenionen vorgeschlagen wurden, bisher nur marginal charakterisiert. Aus diesem Grund wurde in einem Teil dieser Arbeit eine Methode etabliert, um den pH Wert des TGN/EE von Arabidopsis thaliana, in vivo zu messen. Für die spezifische Messung im TGN/EE wurde der genetisch-kodierte pH Sensor pHusion mit dem TGN/EE lokalisierten Protein SYP61 gekoppelt. Mit dieser Methode konnte in Wurzeln von Arabidopsis thaliana ein pH Wert von 5,6 im TGN/EE gemessen werden, der zum Einen von der V-ATPase und zum Anderen von H+ gekoppelten K+ Antiporter der NHX-Klasse bestimmt wird. Desweiteren wurden zwei TGN/EE lokalisierte, potenzielle Anionen/H+ - Transporter aus der ClC-Familie, ClCd und ClCf, untersucht und deren Rolle im Ladungsausgleich des TGN/EE Lumen charakterisiert. Ein gentischer knock-out von ClCd und ClCf ist letal für den männlichen Gametophyten sodass durch eine induzierbare, artifizielle micro RNA gegen ClCf im clcd Hintergrund gezeigt werden konnte, dass ClCd und ClCf eine essentielle Rolle in der Zellelongation besitzen. Eine Veränderung des TGN/EE pH konnte hingegen nicht festgestellt werden und der intrazellulärer Transport ausgehend vom TGN/EE war in induzierten knockdowns von ClCf in clcd ebenfalls nicht beeinträchtigt. Interessanterweise wurde eine Ansäuerung der trans-Golgi Zisterne gemessen, die durch teilweise Misslokalisation der TGN/EE-lokaliseren V-ATPase zur trans-Golgi Seite bedingt wurde. Schließlich wurde über computerbasiertes Modelling eine Funktion von ClCd als Cl-/H+ Antiporter vorgeschlagen. Die Funktion von ClCf und das durch ClCf transportierte Anion konnte nicht zweifelsfrei bestimmt werden. Durch in vivo TGN/EE pH Messungen wurde gezeigt, dass der TGN/EE pH durch die VATPase generiert und durch TGN/EE-lokalisierte Transporter beeinflusst wird. Desweiteren ist neben Protonenimport durch die V-ATPase, Anionenimport in das TGN/EE durch die zwei ClC Transporter ClCd und ClCf essentiell für die Zellelongation, womit eine bisher unbekannte, physiologische Rolle von Anionen/Chlorid im TGN/EE identifiziert wurde.