German Title: Der RNAi-kompetente Malaria-Parasit: Eine neue Strategie, Plasmodiumgene mittels nicht-kanonischer RNA-Interferenz herunterzuregulieren.

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Abstract

Malaria, caused by apicomplexan parasites of the Plasmodium species, is one of the deadliest infectious diseases worldwide. Despite the urgent need to identify new drug targets and vaccine candidates, a large proportion of the Plasmodium genes are uncharacterized, as tools to study gene function are limited. In many eukaryotes, genes can be silenced via RNA interference (RNAi) using artificial short hairpin RNAs (shRNAs). However, Plasmodium parasites lack the machinery required for RNAi. In this study, I therefore engineered a non-canonical RNAi machinery into the rodent parasite Plasmodium berghei (P. berghei). To this end, I exploited a non-canonical RNAi pathway which requires only a single protein, Argonaute 2 (Ago2), and a specifically designed shRNA, a so-called AgoshRNA, for gene silencing. I generated a P. berghei line constitutively expressing Ago2, named PbAgo2, and demonstrated that this parasite can complete its life cycle through the mammalian and insect host, despite exhibiting a reduced growth in blood and mosquito stages. Expression of AgoshRNAs targeting the mRNA of the green fluorescent protein GFP (constitutively expressed by PbAgo2) induced a potent knockdown of GFP both in blood and in non-erythrocytic stages. As different AgoshRNAs mediated gene silencing to various levels, target gene expression could be fine-tuned. AgoshRNA-mediated gene knockdown was also possible for endogenous genes, and the knockdown of a non-essential gene phenocopied the full knockout. Additionally, the expression of a blood-stage-essential gene was reduced using RNAi. The analysis of the transcriptome of PbAgo2 by RNA sequencing suggested a possible interaction between Ago2 and a Plasmodium mRNA storage protein as a putative reason for the growth impairment. To further increase the potential applications of the RNAi-competent parasite, Ago2 expression was restricted to the liver stage using a stage-specific promoter. This transgenic line behavee indistinguishable from wild type and the expression of an AgoshRNA targeting GFP silenced fluorescence exclusively in late liver stages. In summary, PbAgo2 is a potent tool to modulate gene expression without the need to alter the genetic locus. In contrast to existing tools, PbAgo2 provides the option to target genes exclusively in a single life cycle stage, to multiplex different AgoshRNAs enabling the simultaneous knockdown of multiple genes, or to screen for phenotypes using a library of AgoshRNAs. This novel, RNAi-competent parasite line opens a wealth of new options to annotate genes in Plasmodium.

Translation of abstract (German)

Malaria, verursacht von Plasmodium-Parasiten, ist eine der tödlichsten Infektionskrankheiten weltweit. Die Funktion vieler Plasmodium-Gene ist unbekannt, obwohl dieses Wissen für die Entwicklung neuer Medikamente und Impfstoffe unabdingbar ist. Ein Grund dafür ist, dass nur wenige Technologien eine gezielte Manipulation der Genexpression ermöglichen. In vielen Eukaryoten nutzt man RNA-Interferenz (RNAi) zur Unterdrückung der Genexpression mittels kurzer RNA-Moleküle (short hairpin RNAs, shRNAs). Plasmodium-Parasiten haben diesen RNAi Mechanismus jedoch nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde RNAi deshalb in den murinen Erreger Plasmodium berghei (P. berghei) eingeführt. Dazu habe ich einen alternativen RNAi-Mechanismus genutzt, in dem das Protein Argonaute 2 (Ago2) und eine spezielle shRNA, eine sogenannte AgoshRNA, ausreichend sind, um Genexpression zu inhibieren. Die in dieser Arbeit entwickelte P. berghei-Linie PbAgo2, die Ago2 sowie das grün fluoreszierende Protein GFP konstitutiv exprimiert, durchlief trotz eines Wachstumsdefekts in Blut- und Mosquitostadien den Lebenszyklus vollständig. Die Expression von AgoshRNAs gegen die mRNA von GFP reduzierte die Fluoreszenz von Parasiten in allen Stadien und unterschiedliche AgoshRNAs modulierten die Stärke dieser Genrepression. Auch endogene Gene konnten mittels RNAi inhibiert werden, und die Inhibition eines nicht-essentiellen Gens hatte den gleichen Phänotyp wie die vollständige Abschaltung des Gens. Die Analyse des Transkriptoms von PbAgo2 mittels RNA-Sequenzierung deutet darauf hin, dass Ago2 mit einem Plasmodium mRNA-Speicherprotein interagieren könnte und so möglicherweise den Wachstumsdefekt verursacht. Um die Anwendungsmöglichkeiten des RNAi-kompetenten Parasiten zu erweitern, wurde in einer zweiten transgenen Linie Ago2 spezifisch in Leberstadien exprimiert. Diese Linie hat keinen Wachstumsdefekt und ermöglichte es, GFP Expression ausschließlich in Leberstadien zu inhibieren. Zusammengefasst bietet der PbAgo2-Parasit eine vielseitige Technologie, um Gene in Plasmodium zu regulieren ohne dafür den genetischen Lokus zu modifizieren. Im Gegensatz zu aktuellen Technologien ermöglicht es PbAgo2, ein Gen nur in einem spezifischen Stadium des Lebenszyklus zu inhibieren, mehrere Gene parallel durch Expression mehrerer AgoshRNAs zu regulieren, oder Screenings durchzuführen. Dieser neuartige RNAi-kompetente Parasit eröffnet somit neue Möglichkeiten, Genfunktionen in Plasmodium zu erforschen.