German Title: Austesten der Grenzen von Einzelmolekül-Lokalisations-Mikroskopie mit Hilfe realistischer Simulationen mit einem Schwerpunkt auf präsynaptischen Nervenenden

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Abstract

Single molecule localization microscopy (SMLM) has been established as a powerful technique to investigate biological samples with a resolution well below the diffraction limit of light microscopy. However, the limits of these new techniques have not yet been probed. In particular, the localization of multiple targets using different fluorescent dyes is difficult due to chromatic aberrations. Hence, the aim of this project was to build a microscope based on the principle of stochastic optical reconstruction microscopy (STORM), which can be used to simultaneously acquire 3D aberration-free images of two fluorophore-labeled structures, establish an automated imaging workflow and systematically probe the possibilities and limits of SMLM. The microscope was built and used to record images of F-actin and synaptophysin, a protein enriched at synaptic vesicles, in the rat’s calyx of Held, a glutamatergic model synapse. Contrary to our expectations, the experiment resolved neither actin filaments nor clearly distinct synaptic vesicles. To validate the experimental results and to define the limits of SMLM more precisely, a realistic simulation tool for SMLM experiments called SuReSim (super-resolution simulation) was developed. In SuReSim, 3D models of ground truth structures (e.g. filaments or organelles) can be imported and the expected outcome of a SMLM experiment can be simulated taking into consideration a multitude of parameters. Two options for the resulting output are available: either a list of simulated localizations, compatible with SMLM-specific 3D viewers or a realistic Tiff stack resembling raw data as recorded during a SMLM measurement. SuReSim was used to simulate realistic F-actin and synaptophysin imaging results based on model structures derived from electron microscopy. The simulations confirmed the experimental results, no distinct structures could be resolved. Additional simulations were performed on other biological samples to find the limitations of SMLM microscopy. The packing density of the structure, the density of binding sites, the localization precision, the labeling efficiency and the label length were identified as limiting factors for SMLM measurements. Due to the many factors contributing to a SMLM measurement, it is not possible to find universal limits, but only certain sets of parameters that are necessary for a successful experiment. These limits have to be identified individually for each target structure. SuReSim can help to make the decision, whether or not SMLM is the right tool to address a specific research question.

Translation of abstract (German)

Einzelmolekül-Lokalisations-Mikroskopie (SMLM) hat sich als wichtiges Werkzeug durchgesetzt um biologische Proben mit Auflösungen weit jenseits der durch Beugungseffekte verursachten Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie zu untersuchen. Allerdings sind die Schranken dieser neuen Methoden noch nicht hinreichend ausgelotet worden. Insbesondere die Darstellung mehrerer Proteine durch den Einsatz verschiedener Farbstoffe stellt sich aufgrund der chromatischen Aberration als schwierig heraus. Das Ziel meiner Arbeit war daher der Aufbau eines Mikroskops für direkte stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (dSTORM), welches dreidimensionale Aufnahmen von zwei Fluorophor-markierten Strukturen ohne chromatische Aberration ermöglicht, die Entwicklung eines automatisierten Arbeitsablaufs bei der Bildaufnahme und Bildanalyse sowie die systematische Erfassung der Möglichkeiten und Limitierungen der SMLM. Mit dem fertiggestellten Mikroskop wurden Bilder von F-Aktin und Synaptophysin, einem Protein das in synaptischen Vesikeln angereichert ist, in der Heldschen Calyx der Ratte aufgenommen. Wider der Erwartung zeigte das Experiment weder Aktinfilamente noch einzelne Vesikel. Um die experimentellen Ergebnisse zu überprüfen und um die Grenzen von SMLM auszuloten, wurde ein Programm mit Namen SuReSim (Super Resolution Simulation) zur realistischen Simulation von SMLM Experimenten entwickelt. 3D Modelle von Strukturen (z.B. von Filamenten oder Zellorganellen) können in SuReSim eingeladen werden und das zu erwartende Ergebnis eines SMLM Experiments kann basierend auf unterschiedlichen Parametern simuliert werden. Es gibt zwei verschiedene Formen der Ergebnisse der Simulation: entweder kann eine Liste der simulierten Lokalisationen, welche kompatibel ist mit SMLM spezifischen 3D Anzeigeprogrammen erstellt werden oder ein realistischer Film aus mehreren Tiffs, welcher den aufgenommenen experimentellen Daten sehr ähnlich ist. SuReSim wurde zur wirklichkeitsnahen Simulation von F-Aktin und Synaptophysin verwendt, basierend auf Modellen die durch elektronenmikroskopische Daten erstellt wurden. Die Simulationen bestätigten die experimentellen Ergebnisse, es waren keine eindeutigen Strukturen zu erkennen. Durch die Simulation konnte dies auf im Wesentlichen auf die hohe Dichte der Proteine und deren Anordnung sowie auf weitere Faktoren wie die Dichte der Bindungsstellen, die Lokalisierungsgenauigkeit, Markierungseffizienz und die Länge des verwendeten Markierers zurückgeführt wurden. Simulationen weiterer biologischer Strukturen wurden durchgeführt um die Grenzen der SMLM präziser zu definieren. Da viele Faktoren Einfluss auf SMLM Messungen haben, ist es nicht möglich allgemeingültige Grenzen zu finden, lediglich gewisse Kombinationen an Parametern, die für ein erfolgreiches Experiment nötig sind. Diese Grenzen müssen für jede Zielstruktur einzeln gefunden werden. SuReSim trägt dazu bei, vor dem Beginn aufwendiger Experimente herauszufinden, ob sich SMLM zur Untersuchung einer gegebenen Fragestellung eignet und welche Parameter für ein erfolgreiches Experiment eingehalten werden müssen.