German Title: Der Egfr-signatransduktionsweg in Oryzias latipes - Charakerisierung induzierbarer Onkogen gain-of-function und Rezeptor loss-of-function Medaka linien

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Abstract

One of the major growth-promoting factors in animal development and growth is the epidermal growth factor receptor (Egfr). The Egfr pathway is involved in proliferation, cell survival, migration and differentiation and is one of the most commonly deregulated pathways in cancer. Medaka fish have two copies of the egfr gene, egfr a and b, which have so far not been analyzed for their particular function and redundancy. To understand the role of Egfr signaling in the neural stem cell zones of the retina and the brain, we performed a whole mount in situ hybridization screen for egfrs, selected ligands as well as selected downstream signal transducers. We found that both egfrs are broadly and overlapping expressed during development and more specifically in proliferative zones of the brain and the ciliary marginal zone in hatchlings. To determine the effect of enhanced growth signaling on the retinal stem and progenitor cells we created a versatile toolbox for targeted induction of Egfr-related oncogenes (Xmrk, myrAKT, and K-Ras12V) in cell types of interest. To this end, we tagged the Egfr variant Xmrk with a fluorescent protein and demonstrated its oncogenicity in a somitic overproliferation assay. A Cre-loxP based induction of oncogenes in single cells in somites and also in the retina was successfully achieved in transient and stable lines, and multiple lines were generated. The analysis of oncogenic effects on RSCs was however hampered by the loss of visible expression in later generations in the retina and brain. To analyze the specific role of Egfra in development and growth I generated a CRISPR/Cas9 based knockout (KO) disrupting the open reading frame by GFP-plasmid insertion or deletion and analyzed the resulting phenotype. Egfra-KO fish develop and reproduce normally but have a defect in oogenesis. Oocytes derived from homozygous Egfra-KO females contain multiple sperm entry sites (micropyles), which causes polyspermy and therefore lethality. The characterization of the polyspermy phenotype, as well as the oogenesis defect in adult ovaries, points towards a role of Egfra in the communication between the granulosa cell layer and the oocyte to specify the micropyle. By generation of genetic loss and gain of function tools for Egfra and related oncogenes, this work will contribute to understanding the general and the more specific role of Egfr signaling in growth and development of the Medaka fish.

Translation of abstract (German)

Der Epidermal growth factor (Egf) Rezeptor ist ein SchlüsselfAKTor in der Entwicklung und dem Wachstum von Tieren. Der Egf-Rezeptor Signalweg steuert Zellteilung, Zellmigration, Zellüberleben und Differenzierung und ist einer der am häufigsten deregulierten Signalwege in Tumoren. Der Medaka Fisch hat zwei Kopien des Rezeptors: a und b, deren Funktion bisher nicht bekannt ist. Des Weiteren ist unerforscht inwieweit sich beide Rezeptoren in ihrer Funktion unterscheiden oder ob sie redundant agieren. Um die Rolle des Egf-Signalweges in den neuronalen Stammzellregionen der Retina und des Gehirns besser zu verstehen wurde ein In Situ Hybridisierung Screening durchgeführt. Hierfür wurden Sonden für die Erkennung der mRNA beider Egf-Rezeptoren sowie ausgewählter Liganden und Signalübertragungsproteine verwendet. Die Untersuchung hat ergeben, dass die Gene beider Egf-Rezeptoren großflächig und überlappend während der Entwicklung, jedoch später auch in den Stammzellzonen der Retina und des Gehirns abgelesen werden. Um heraus zu finden ob ein erhöhtes Wachstumssignal eine Auswirkung auf das Verhalten retinaler Stamm- und Vorläuferzellen hat, haben wir eine Reihe von vielseitigen transgenen Fischlinien entwickelt, die es erlauben, Egf-Rezeptor verwandte Onkogene (Xmrk, myrAKT, and K-Ras12V) in einzelnen Zellen oder Zelltypen zu exprimieren. Hierfür haben wir eine onkogene Variante des Egf-Rezeptors, Xmrk, mit einem fluoreszierenden Protein verbunden und die Fähigkeit der Rezeptorvariante, die Zellteilung anzuregen, in einem in vivo Zellteilungsassay bestätigt. Ein auf Cre-Lox Rekombination basierendes System ermöglichte es erfolgreich Onkogene in einzelnen Zellen in den Somiten und in der Retina zu exprimieren. Diverse induzierbare Onkogen-Fischlinien wurden generiert und getestet, jedoch wurde die Analyse der Onkogeneffekte auf retinale Stammzellen dadurch erschwert, dass in späteren Generationen der Onkogen-Linien keine sichtbare Expression des fluoreszierenden Onkogens mehr detektiert werden konnte. Die spezifische Funktion des Egf-Rezeptors a in Entwicklung und Wachstum des Medaka Fisches wurde untersucht, indem das Gen mit Hilfe der CRISPR/Cas9 Technologie deAKTiviert wurde. Homozygote Träger beider Mutationen, eine GFP-Plasmid Insertion sowie eine Deletion von 12 Basen, wurden auf ihren Phänotyp hin untersucht. Egf-Rezeptor mutante Fische sind lebensfähig und in ihrer Fortpflanzung nicht beeinträchtigt; die Nachkommen homozygoter Weibchen weisen jedoch einen spezifischen Defekt bei der Oogenese auf. Homozygote Egf-Rezeptor a mutierte Weibchen produzieren Eier, die mehrere Mikropyle in ihrem Chorion aufweisen, die die Befruchtung der Eizelle mit mehreren Spermien ermöglichen (Polyspermie) und daher zum Absterben der Embryonen führen. In dieser Arbeit wurde der Phänotyp der Polyspermie sowie der Oogenesedefekt charAKTerisiert. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Egf-Rezeptor a eine wichtige Rolle bei der Kommunikation zwischen der Eizelle und der umgebenden Granulosa-Zellschicht spielt, die für die Ausbildung des Mikropyle verantwortlich ist. Durch die Entwicklung genetischer „Gain- and Loss-of-Function“ Systeme für Egf-Rezeptor a und verwandte Onkogene wird diese Arbeit dazu beitragen, die spezifische Rolle des Egf-Signalwegs in Entwicklung und Wachstum des Medaka Fisches zu verstehen.