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Abstract

The detection of cancerous cells by the immune system elicits spontaneous antitumour im-mune responses. Still, during their progression, tumours acquire characteristics that enable them to escape immune surveillance. Cancer immunotherapy aims to reverse tumour im-mune evasion by activating and directing the immune system against transformed tumour cells. However, the tumours’ intrinsic resistance mechanisms limit the success of many im-munotherapeutic approaches. The functionally and morphologically abnormal tumour vascu-lature forms a physical barrier and prevents the entry of tumour-reactive immune effector cells, while the immunosuppressive tumour microenvironment impairs their function. To block tumour immune evasion, therapeutic strategies are being developed that combine cancer immunotherapy with treatment modalities, such as radiotherapy, that reprogram the tumour microenvironment to increase treatment efficacies and improve clinical outcome. In various preclinical models radiotherapy was shown to enhance the efficacy of adoptive T cell therapy. Our group showed that in the RIP1-TAg5 mouse model of spontaneous insulinoma, the transfer of in vitro-activated tumour-specific T cells induces T cell infiltration and pro-motes long-term survival only in combination with neoadjuvant local low dose irradiation (LDI). These treatment effects were mediated by iNOS+ macrophages. In this thesis, we investigated the mechanisms underlying the improved T cell infiltration and prolonged survival upon combination therapy with adoptive T cell transfer and local LDI. We demonstrate that combination therapy leads to a normalization of the aberrant tumour vas-culature and endothelial activation, an increase in intratumoural macrophages, a reduction of intratumoural myeloid derived suppressor cells and, most importantly, to tumour regres-sion. These findings suggest that this treatment inhibits tumour immune suppression but also facilitates immune effector cell infiltration through the normalization of the tumour vasculature, finally leading to tumour immune rejection. Inhibition of the inducible nitric oxide (NO) synthase (iNOS) revealed that these effects largely depend on its activity. Of note, the stimulation of human endothelial cells with low doses of the NO donor DETA NONOate activates the endothelial cells to upregulate adhesion molecules, indicating that in response to the combination therapy, iNOS-derived NO directly activates tumour endothelial cells, thereby promoting T cell infiltration and tumour immune rejection. Moreover, adoptive transfer of low dose irradiated peritoneal macrophages into unirradiat-ed RIP1-TAg5 mice prior to adoptive T cell transfer resulted in effects corresponding to the combination treatment, which highlights the role of macrophages in this mechanism. Whole transcriptome analysis of the irradiated peritoneal macrophages revealed that LDI causes gene expression and functional changes in these cells. Specifically, LDI activated interferon signalling and induced the upregulation of interferon regulated genes. This effect is likely due to the detection of danger signals released from damaged cells, which primes macro-phages and induces a shift in their polarization state. Signal transduction and amplification of interferon responses is mediated by interferon regulatory factors like IRF7. These transcription factors induce the expression of proinflammatory genes such as Nos2. Irf7 but also Nos2 and various proinflammatory genes like tumour necrosis factor (Tnf) were upregulated in response to LDI. Since NO and TNF-α are mediators of endothelial activation, this finding represents the link between LDI and macrophage-mediated activation of the tumour endothelium. In conclusion, the presented thesis demonstrates that macrophages with proinflammatory phenotypes are required for the activation of tumour endothelial cells, which in turn is criti-cal for the infiltration of immune effector cells and, thereby, for tumour immune destruction. Therefore these findings are of great importance for future immunotherapeutic approaches in the treatment of cancer patients.

Translation of abstract (German)

Die Erkennung maligne entarteter Zellen durch das Immunsystem löst spontane Immunant-worten aus, um die entarteten Zellen zu eliminieren. Während der Krebsentstehung entwi-ckeln die Tumorzellen jedoch Eigenschaften, die es ihnen ermöglichen sich der Erkennung durch das Immunsystem zu entziehen. Krebsimmuntherapien haben zum Ziel diese Prozesse umzukehren und das Immunsystem sowohl zu aktivieren als auch gegen Tumorzellen zu rich-ten. Allerdings beeinträchtigen verschiedene Resistenzmechanismen der Tumorzellen die Wirkung vieler immuntherapeutischer Ansätze. Dabei stellen die funktionell und morpholo-gisch veränderten Tumorgefäße ein Hindernis für die Einwanderung von Immuneffektorzel-len dar. Die Funktion der Immuneffektorzellen wird zudem durch das immunsuppressive Tumormikromilieu eingeschränkt. Um dem entgegenzuwirken, werden effektivere therapeu-tische Strategien entwickelt. Die Kombination von Immuntherapie mit Behandlungsmodali-täten, die das Tumormikromilieu umprogrammieren, kann die Wirksamkeit der Behandlung optimieren und somit klinische Resultate verbessern. Verschiedene präklinische Tumormo-delle zeigten eine erhöhte Wirksamkeit von adoptiven T-Zell Therapien durch Kombination mit Strahlentherapie. Unsere Gruppe hat in RIP1-TAg5 Mäusen, welche spontan Insulinome entwickeln, gezeigt, dass der Transfer von in vitro-aktivierten tumor-spezifischen T-Zellen sowohl die Einwanderung von T-Zellen in den Tumor induziert als auch das Langzeitüberle-ben fördert, unter der Voraussetzung, dass der adoptive Transfer mit neoadjuvanter lokaler Niedrigdosisbestrahlung kombiniert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Effekte der Behandlung durch iNOS+ Makrophagen vermittelt werden. In der vorliegenden Arbeit haben wir die Mechanismen untersucht, die der erhöhten T-Zell Infiltration und dem verlängerten Überleben nach der Therapie mit lokaler Niedrigdosisbe-strahlung und adoptivem T-Zell Transfer zu Grunde liegen. Wir zeigten, dass diese Kombina-tionstherapie zu einer Normalisierung der abnormalen Tumorvaskulatur, sowie zur En-dothelaktivierung führt. Außerdem wurde eine Vermehrung intratumoraler Makrophagen, eine Reduktion intratumoraler myeloider Suppressorzellen und der Rückgang etablierter Tumore beobachtet. Diese Untersuchungsergebnisse weisen darauf hin, dass diese Behand-lung die Immunsuppression durch die Tumorzellen hemmt und gleichzeitig, mittels der Ge-fäßnormalisierung, die Infiltration von Immuneffektorzellen in den Tumor fördert. Zusam-men führt dies zur Abstoßung der Tumore durch das Immunsystem. Eine Hemmung der in-duzierbaren Stickstoffmonoxid (NO) Synthase (iNOS) zeigte, dass die Behandlungseffekte entscheidend von deren Aktivität abhängen. Zudem führte die Stimulation humaner En-dothelzellen mit niedrigen Konzentrationen des NO-Donors DETA NONOat zu einer erhöhten Expression von Adhäsionsmolekülen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Kombina-tionstherapie zur erhöhten NO Produktion durch iNOS führt. NO aktiviert die Tumo-rendothelzellen und fördert damit die Einwanderung von T-Zellen, was letztlich zur Absto-ßung der Tumore führt. Darüber hinaus wurden bei einem Transfer peritonealer Makrophagen aus Niedrigdosis be-strahlten wildtyp Mäusen in unbestrahlte RIP1-TAg5 Mäuse, gefolgt von einem adoptiven T-Zell Transfer, Effekte beobachtet, die denen nach Kombinationstherapie entsprechen, wodurch die Bedeutung der Makrophagen in dem Mechanismus verdeutlicht wird. Genom-weite Transkriptomanalysen bestrahlter peritonealer Makrophagen ermöglichte die Unter-suchung genetischer und funktioneller Veränderungen, die durch die Niedrigdosisbestrah-lung hervorgerufen wurden. Demnach zeigen bestrahlte Makrophagen eine Aktivierung des Interferon Signalwegs, sowie eine erhöhte Expression interferon-regulierter Gene. Durch Strahlung geschädigte und gestresste Zellen setzen so genannte „danger“ Signalmoleküle frei, die von Makrophagen erkannt werden. Die Detektion dieser Moleküle führt zur Aktivie-rung der Makrophagen und schließlich zu einer Interferonantwort. Transkriptionsfaktoren wie die Interferon regulatorischen Faktoren (IRF), darunter IRF7, spielen bei der Signaltrans-duktion und -amplifikation von Interferonantworten eine zentrale Rolle. Diese Transkripti-onsfaktoren induzieren unter anderem die Expression von Nos2. Die Expression von Irf7 so-wie Nos2 und von verschiedenen profinflammatorischen Genen wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (Tnfa) waren nach Niedrigdosisbestrahlung in den peritonealen Zellen erhöht. Da NO und TNF-α die Endothelaktivierung auslösen können, stellt diese Beobachtung eine Verbindung zwischen Niedrigdosisbestrahlung und der Makrophagen-vermittelten Aktivierung des Tu-morendothels dar. Diese Arbeit verdeutlicht die Rolle proinflammatorischer Makrophagen bei der Aktivierung von Tumorendothelzellen, welche für die Infiltration von Immuneffektorzellen und somit für die Tumorimmunabwehr essentiell ist. Die Erkenntnisse aus dieser Arbeit sind daher von großer Bedeutung für zukünftige immuntherapeutische Ansätze bei der Behandlung von Krebspatienten.