German Title: Hochgradige Parallelisierung der STED-Nanoskopie

Preview

PDF, English - main document Download (23MB) | Terms of use

Abstract

Fluorescence microscopy constitutes a key method for the virtually non-invasive study of biological structures and processes on a subcellular scale. Stimulated Emission Depletion (STED) nanoscopy extends fluorescence imaging to nanometer resolutions. However, this method usually acquires an image by scanning small pixels in a sequential manner, which can lead to long acquisition times of several minutes. This limits the feasibility of many large-scale superresolution experiments, because faster acquisition times imply sacrificing either highest resolution, a good signal-to-noise ratio or a large image size. To unleash the full spatio-temporal resolving power potential of STED nanoscopy on a large imaging region, massively parallelized acquisition is therefore inevitable. In this thesis, I develop a comprehensive and quantitative description of parallelized STED and validate the derived findings by means of two experimental implementations. Investigating the key technical parameters and their interplay reveals the possibility of reducing the laser power by up to three orders of magnitude below the value required for serially acquiring STED systems. This eliminates a major bottleneck of previously reported attempts to parallelize STED nanoscopy, limiting them to tiny image sizes or inferior resolutions. Moreover, using a rather simple optical arrangement, I was able to enlarge the superresolved image area to 33 μm edge length (roughly the dimensions of a small cell), featuring a resolution down to 30 nm and a 13000-fold degree of parallelization. While the implementations presented here should be viewed as prototypes, they prove the technical feasibility of massively parallelized STED nanoscopy. The methods developed in this thesis in combination with suitable high-speed detectors bring video-rate STED nanoscopy of whole cells within reach.

Translation of abstract (German)

Fluoreszenzmikroskopie ist eine Schlüsselmethode zur minimal-invasiven Untersuchung subzellulärer biologischer Strukturen und Prozesse. Die sogenannte Stimulated Emission Depletion (STED) Nanoskopie erweitert das Auflösungsvermögen bis hinein in den Nanometerbereich. Typischerweise wird dabei die Probe Pixel für Pixel abgetastet. Dieser sequentielle Scanprozess kann allerdings zu Bildgestehungszeiten von mehreren Minuten führen und den Einsatz im großen Maßstab erschweren. Um kürzere Aufnahmezeiten zu ermöglichen, muss entweder Auflösungsqualität, Signal-zu-Rausch-Verhältnis oder Bildgröße geopfert werden. Für die Anwendung von STED mit höchster räumlicher und zeitlicher Auflösung auf einer großen Bildfläche führt deshalb kein Weg an Parallelisierung vorbei. Diese Arbeit bietet eine umfassende, quantitative Darstellung der Theorie parallelisierten STEDs und überprüft die wichtigsten Ergebnisse mithilfe zweier experimenteller Mikroskopieaufbauten. Die Analyse der zentralen Parameter und deren Zusammenwirken zeigt, dass im Vergleich zur sequentiellen STED Variante eine um bis zu drei Größenordnungen geringere Laserleistung notwendig ist. Dies ist insofern wichtig, als bisher publizierte Versuche STED zu parallelisieren aufgrund unzureichender Laserleistungen in Bildfeld und Auflösung stark eingeschränkt waren. In der vorliegenden Arbeit konnte mit einem sogar vergleichsweise einfachen optischen Aufbau eine Auflösung von bis zu 30 nm und eine 13000-fache Parallelisierung auf einem Bildfeld von 33 μm Kantenlänge erzielt werden. Das entspricht der Größe einer kleinen Zelle. Trotz ihres prototypischen Charakters beweisen die in dieser Arbeit vorgestellten optischen Aufbauten, dass eine hochgradige Parallelisierung der STED-Nanoskopie möglich ist. Mit der in naher Zukunft zu erwartenden Verfügbarkeit von Kameras mit entsprechend hoher Aufnahmegeschwindigkeit rücken Videos lebender Zellen in STED-Auflösungsqualität in greifbare Nähe.