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Abstract

In metazoans the regulation of transcription commonly relies on multiple types of regulatory elements. Often these elements are separated from their target promoters by great genomic distance and can even have other genes in between. Current models propose the chromosomes to be folded following a specific topology in order to allow these long-range interactions to occur. In addition to the locus topology, chromatin environment and DNA accessibility play an important role to determine the activity of regulatory elements. Thanks to genome-wide studies these layers of regulation have been shown to correlate with gene expression to different extents, however it is still not clear how chromatin, DNA topology and genetic components integrate in order to carry out this process. With this project we aim to understand basic mechanisms organizing promoter–regulatory elements communication in a defined model locus. A previous project from the laboratory used chromosomal deletions and in vivo reporter assays to identify and characterize regulatory elements in c-Myc locus. This study, performed by Veli Uslu showed that during mouse embryonic development, at 11.5 days of gestation, different enhancers coordinate c-Myc transcription in the facial tissues and embryonic liver. We analyzed the distribution inside c-Myc locus of histone modifications enriched at enhancer sites, restricting to few smaller putative regions the genetic position of facial and liver enhancers. We also assessed the occupancy of the architectural protein CTCF, enriched at sites involved in long- range interactions and on insulators, finding both tissue-invariant and tissue-specific binding sites at different parts of the locus. To study if the topology of the locus influences enhancer promoter communication and how it does this, we created three lines of mice carrying different chromosomal inversions. Each of which reshuffles the relative positions of the different genetic elements: c-Myc promoter, enhancers and CTCF binding sites. The observed effects of the genetic engineering include significant reductions of c-Myc expression in the facial tissues and redirection of regulatory activity to other 1 genes. In the liver we saw instead milder and non-significant effects of the inversions on c-Myc regulation. We investigated the occupancy of CTCF and the Cohesin complex subunit RAD21 (another architectural protein) in the facial mesenchyme and liver, on the engineered lines, detecting in c-Myc locus just some minor changes compared to the Wt. Our data suggest that the architecture of the loci may have a functional role in organizing promoters-regulatory elements interactions, and, if altered, can lead to genes misexpression. In case architectural proteins are involved in this process, our data suggests that their binding to the genome, not significantly altered by genetic reshuffling, may be mostly determined by the DNA sequence (genetics). On the other hand, it is possible that the long-range interactions engaged by these proteins may be influenced more by their working context.

Translation of abstract (German)

Bei vielzelligen Tieren stützt sich die Regulierung der Transkription häufig auf mehreren regulativen Elementen. Oft besteht zwischen diesen Elementen und ihren Zielpromotoren ein großer genetischer Abstand und es können sich auch andere Gene zwischen ihnen befinden. Die aktuellen Modelle sehen vor, dass die Chromosomen nach einer bestimmten Topologie gefaltet sind, um das Entstehen dieser long-range interactions zu ermöglichen. Zusätzlich zu der Locus Topologie spielen die Chromatin-Umgebung und die DNA Zugänglichkeit eine wichtige Rolle, um die Aktivität der regulativen Elemente zu bestimmen. Dank genomweiter Studien wurde bewiesen, dass diese Schichten der Regulierung mit der Genexpression unterschiedlichen Ausmaßes korreliert sind. Es ist jedoch noch nicht klar, wie Chromatin, DNA-Topologie und genetische Komponenten interagieren, um diesen Vorgang durchzuführen. Mit diesem Projekt zielen wir darauf ab, die grundlegenden Mechanismen der Organisation bei der Kommunikation von Promotor-Regulationselementen in einem definierten Locus- Modell zu verstehen. In einem vorherigen Projekt des Labors wurden chromosomale Deletionen und in-vivo Reporter-Assays verwendet, um die regulatorischen Elemente in c-Myc Locus zu identifizieren und charakterisieren. Diese Studie, durchgeführt von Veli Uslu, zeigte, dass während der Embryonalentwicklung von Mäusen, bei 11,5 Tagen Trächtigkeit, verschiedene Transkriptionsverstärker die c-Myc-Transkription im Gesichts-Mesenchym mit der embryonalen Leber koordinieren. Wir untersuchten die Verteilung innerhalb des c-Myc-Locus von an den Enhancer Sites angereicherten Histon-Modifikationen, um die genetische Position der Gesichts- und Leber Enhancer auf kleinere putative Regionen zu beschränken. Wir untersuchten auch die Belegung der Isolatoren als auch des architektonischen Proteins CTCF‘s, an den Standorten, die in die weitreichenden Wechselwirkungen involviert sind. Folglich fanden wir sowohl Gewebe-Invarianten als auch gewebespezifische Bindungsstellen in verschiedenen Teilen des Locus. Wir betrachteten die Rolle der Locus Topologie in der Beeinflussung der Promoter-Enhancer-Kommunikation mit der Schaffung von drei ausgeglichenen chromosomalen Inversionen innerhalb des Locus. Jede dieser Inversionen soll die Positionen der c-Myc-Promotoren und die Langstrecken-Enhancer, sowie CTCF Bindungsstellen auf spezifische Weise neu vermischen. Wir beobachteten Umleitungen von Regulierungstätigkeiten (anhand der in-vivo-Reporter-Assays) und signifikante Reduktion von c-Myc Expression im Gesichts-Mesenchym. In der 3 Leber hingegen beobachteten wir eine leichtere und nicht erhebliche Auswirkung der Inversionen auf die c-Myc-Regulierung. Wir untersuchten die Belegung von CTCF und der Untereinheit vom Cohesin komplexen RAD21 (ein weiteres architektonisches Protein) im Gesichts- Mesenchym und in der Leber, auf den technischen Linien, mit Erfassung im c-Myc Locus von nur einigen kleineren Veränderungen im Vergleich zu dem Wt. Unsere Daten suggerieren, dass die Architektur der Loci eine funktionelle Rolle in der Organisation der regulativen Promotor-Elemente haben kann. Wenn diese verändert werden, kann dies zur Gen-Fehlexpression führen. Die gewebespezifischen Auswirkungen der Gentechnik, die wir am c-Myc-Locus beobachten konnten, könnte die Tatsache widerspiegeln, dass verschiedene Gewebe unterschiedlich lokalisierte Topologien implementieren, um spezifische, weitreichende Wechselwirkungen zu fördern. Wenn architektonische Proteine an diesem Prozess beteiligt sind, weisen unsere Daten darauf hin, dass deren Bindung zum Genom, das nicht signifikant durch genetische Umordnung verändert ist, vor allem durch die DNA-Sequenz (Genetik) bestimmt werden kann. Es ist jedoch möglich, dass die weitreichenden Wechselwirkungen, die sie durchleben, stärker durch den Kontext beeinflusst werden, in dem sie eingesetzt sind.