German Title: Epigenetische Charakterisierung des C3(1) SV40T Mausmodells für Brustkrebs im Menschen

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Abstract

Breast cancer is a heterogeneous disease, and various subtypes have been defined at the level of gene expression and epigenetic modifications, such as DNA methylation. Epigenetic alterations are attractive candidates for the development of novel biomarkers or as targets for new therapeutic approaches. Mouse models allow monitoring of tumor development from early time points of initiation to final stages of tumorigenesis, but are often poorly characterized with respect to alterations of the epigenetic landscape. Therefore, the aim of this thesis was to generated genome-wide profiles of DNA methylation and histone modifications for the C3(1)SV40TAg (C3(1)) mouse model of basal-like breast cancer and to investigate the epigenetic regulation of long noncoding RNAs. Using a genome-wide screen with Methyl CpG Immunoprecipitation followed by next generation sequencing, we identified several thousand regions with recurrent methylation alterations at different stages of C3(1) tumorigenesis. Differentially methylated genes pointed towards a luminal progenitor as tumor cell of origin in the C3(1) model, and we confirmed a link between DNA methylation and gene expression for five of these genes. Comparisons at the level of promoter methylation revealed general similarity of the C3(1) methylome to human breast cancer. Generation of a chromatin map of the C3(1) model from four histone modifications (H3K4me3, H3K4me1, H3K27ac, H3K27me3) allowed an integrative investigation of methylation changes at breast tissue-specific enhancer regions. We linked tissue-specific alterations of chromatin states in combination with DNA methylation to changes in the expression of genes with importance for mammary gland development and breast cancer. These results unveiled a potential involvement of transcription factors Etv4 (ETS variant 4) and Runx1 (runt related transcription factor 1) in C3(1) tumorigenesis that might help to understand tumor development in basal-like breast cancer. An emerging theme in epigenetic research is the capacity of long noncoding RNAs (lncRNAs) to modulate gene expression by recruitment of gene-silencing or activating complexes. Since regulation of lncRNAs expression is poorly characterized, we investigated DNA methylation changes during carcinogenesis at lncRNA promoters and their influence on neighboring proteincoding genes. Exemplarily, we demonstrated coordinated overexpression of Esrp2 (Epithelial splicing regulatory protein 2) and the lncRNA Esrp2-as (Esrp2-antisense) in C3(1) tumors that was inversely correlated with DNA methylation levels. Knockdown and overexpression of the transcripts did not provide evidence for reciprocal regulation of transcript expression. In contrast, luciferase reporter assays suggested that co-expression of both transcripts is controlled by differential methylation at a common enhancer region. These results are of clinical relevance as high levels of ESRP2 expression in human breast cancer are linked to unfavorable prognosis.

Translation of abstract (German)

Brustkrebs ist eine heterogene Erkrankung und basierend auf Unterschieden in der Genexpression oder von epigenetischen Modifikationen, wie zum Beispiel von DNA Methylierung, wurden verschiedene Subtypen definiert. Epigenetische Veränderungen sind attraktive Kandidaten für die Entwicklung neuer Biomarker oder neuer Ansätze zur gezielten Krebstherapie. Der Einsatz von Mausmodellen ermöglicht es dabei, die gesamte Tumor-entwicklung von Beginn an, bis zu den finalen Stadien zu beobachten. Allerdings sind Mausmodelle in Bezug auf epigenetische Veränderungen bisher unzureichend charakterisiert. Deshalb war es das Ziel dieser Arbeit, genomweite Profile für Veränderungen der DNA Methylierung und von Histonmodifikationen im C3(1)SV40TAg (C3(1)) Modell für basalen Brustkrebs zu erstellen, sowie die epigenetische Regulation von langen nicht-kodierenden RNAs zu untersuchen. Mithilfe von Methyl-CpG-Immunpräzipitation gefolgt von Sequenzierung der angereicherten Fragmente haben wir genomweit mehrere tausend Regionen identifiziert, deren DNA Methylierung sich über verschiedene Stadien der C3(1) Tumorentwicklung konsistent verändert hat. Die von differenzieller Methylierung betroffenen Gene ließen darauf schließen, dass eine Population von luminalen Vorläuferzellen den Ausgangspunkt der Tumorentstehung im C3(1) Modell darstellen könnte. Bei fünf von diesen Genen konnten wir eine Verbindung zwischen DNA Methylierung und Genexpression bestätigen. Der Vergleich der Promoter Methylierung ergab außerdem, dass eine generelle Ähnlichkeit zwischen dem C3(1) Methylom und dem von humanem Brustkrebs besteht. Um eine Karte der Chromatinlandschaft zu erstellen, wurden vier Histonmodifikationen (H3K4me3, H3K4me1, H3K27ac, H3K27me3) auf genomweiter Ebene analysiert. Dies erlaubte die integrative Untersuchung von Veränderungen in der Methylierung an brustgewebsspezifischen Enhancer-Regionen. Dabei fanden wir einen Zusammenhang zwischen Genexpression und gewebstypischen epigenetischen Veränderungen, insbesondere bei Genen, die eine Rolle bei der Entwicklung der Brust und von Brustkrebs spielen. Ebenso konnte ein potenzieller Einfluss der Transkriptionsfaktoren Etv4 (engl. ETS variant 4) und Runx1 (engl. Runt related transcription factor 1) für die C3(1) Tumorigenese identifiziert werden. Diese Ergebnisse könnten dabei helfen die Tumorentstehung in basalem Brustkrebs besser zu verstehen. Ein Thema von zunehmender Bedeutung für die epigenetische Forschung ist die Fähigkeit langer nicht-kodierender RNAs (lncRNAs), aktivierende oder hemmende Komplexe an die DNA zu rekrutieren, um dadurch die Genexpression zu regulieren. Da die Regulation der Expression für lncRNAs schlecht charakterisiert ist, haben wir krebsspezifische Veränderungen in der Methylierung von lncRNA Promotoren untersucht und wie diese benachbarte protein-kodierende Gene beeinflussen. In diesem Zusammenhang bestätigten wir exemplarisch die Zusammenfassung 10 Überexpression von Esrp2 (engl. Epithelial splicing regulators protein2) und der lncRNA Esrp2- as (engl. Esrp2-antisense) in C3(1) Tumoren. Expressionslevel waren dabei invers korreliert mit DNA Methylierung. Knockout sowie gezielte Überexpression der Transkripte erbrachten keine Hinweise für eine wechselseitige Regulation der Expression. Dagegen konnten Untersuchungen mit Luciferasereportern die Hypothese stützten, dass die Ko-Expression beider Transkripte durch differenzielle Methylierung einer gemeinsamen Enhancer-Region kontrolliert wird. Diese Ergebnisse haben auch klinische Relevanz, da hohe Expression von ESRP2 in humanem Brustkrebs mit einer ungünstigen Prognose assoziiert ist.