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Abstract

Only with the evolution from circular to linear genomes, allowing easy exchange of genetic information by sexual reproduction, complex organisms with large genomes could evolve. But the linearity of a chromosome inherits a major problem, namely two chromosome ends that have to be protected. Telomeres at the very end of the chromosomes ensure cell survival. These nonprotein coding DNA repeats are essential features of chromosomes, as their loss leads to irreversible cellular senescence and chromosome loss. Paradoxically, telomeres resemble DNA double-strand breaks (DSBs), however, unlike DSBs, they are refractory to repair events. This socalled “end protection” function carried out by telomeres ensures that chromosomes do not fuse together in an end-to-end manner and avoids the DNA damage response machinery from being activated, leading to cell cycle arrest. Although end protection has largely been attributed to the major telomere binding complexes such as shelterin in mammals and the CST complex in yeast, it has also been proposed that a three-dimensional structure at the telomere may contribute to safeguarding telomeres. These so called telomere loops (t-loops) have been demonstrated via electron- and super-resolution-microscopy in mammalian cells, however, the short length and base composition of yeast telomeres prevent such approaches. By using a combination of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and transcriptional readouts it has been demonstrated that yeast telomeres loop back onto their respective subtelomeres; however, both methods are indirect and unsatisfactory in terms of analyzing the dynamic regulation of loop structures. In this study we have established a new assay based on Chromosome Conformation Capturing (3C) to directly detect and quantify interactions between a telomere and its subtelomeric region in S. cerevisiae, as a measure of telomere looping. In this manner we could exploit the genetic advantages of the yeast system to understand the mechanistic details of telomere loop formation and maintenance. Since telomere shortening leads to an unprotected telomere, we wondered whether telomere length may have an impact on looping. We were able to show a significant looping defect in cells that lack telomerase as well as in other mutants that harbor short telomeres. On the contrary, elongated telomeres were able to maintain the looped structure. This suggests that a critical telomere length is essential to maintain the telomere loop and that telomeres in senescent cells are likely in an open conformation, rendering them susceptible to nucleolytic end resection and unscheduled DNA repair events. Gene looping is another kind of looped chromatin that brings promoter and terminator together. Gene loops depend on transcription, a functional transcription initiation complex and several components of the mRNA processing machinery. Indeed, we could detect a telomere looping defect upon loss of RNA polymerase II and in a mutant of the transcription preinitiation complex (sua7-1). It has been shown that certain chromatin loops that bring promoter and enhancer regions in close proximity depend on a non-coding RNA species that interacts with components of the promoter associated mediator complex. Depletion of total RNA levels or mutation of mediator resulted in a telomere looping defect, indicating a similar regulation at the telomere.

Translation of abstract (German)

Erst mit der Evolution von zirkulären zu linearen Genomen, die einen einfachen Austausch von genetischen Informationen durch sexuelle Reproduktion erlaubten, konnten sich komplexe Organismen mit großen Genomen entwickeln. Die Linearität eines Chromosoms verursacht allerdings ein großes Problem, nämlich zwei Chromosomenenden, die geschützt werden müssen. Telomere am äußeren Ende der Chromosomen gewährleisten das Überleben der Zellen. Diese nicht für Proteine kodierenden, sich wiederholenden DNA-Sequenzen sind essenzielle Merkmale von Chromosomen, da ihr Wegfall zu zellulärer Seneszenz und Chromosomenverlust führt. Paradoxerweise ähneln Telomere DNA-Doppelstrangbrüchen, allerdings sind sie, im Gegensatz zu Doppelstrangbrüchen, renitent gegenüber Reperaturvorgängen. Diese Schutzfunktion von Telomeren verhindert die Fusion von Chromosomen und die Aktivierung der DNA Schadensreaktion, die zu einer Zellzyklus-Arretierung führen würde. Obwohl diese Schutzfunktion vor allem den wichtigsten Telomer-Bindekomplexen wie shelterin in Säugetieren und dem CST Komplex in Hefe zugeschrieben wird, wurde ebenfalls eine dreidimensionale Struktur am Ende der Telomere vorgeschlagen, die die Telomere schützt. Diese sogenannten Telomerschleifen (telomere loops oder t-loops) wurden mittels Elektronen- und hochauflösender Mikroskopie in Säugerzellen gezeigt, die kurze Länge und Basenkomposition der Telomere in Hefe erlauben diesen Ansatz allerdings nicht. Mittels einer Kombination von Ko-Immunpräzipitation und eines transkriptionellen Auslesesystems wurde gezeigt, dass auch Telomere in Hefe auf ihre jeweiligen Subtelomere zurückfalten. Nichtsdestotrotz sind beide Methoden indirekt und nicht zufriedenstellend bezüglich der Analyse der dynamischen Regulation von Schleifenstrukturen. In dieser Studie haben wir ein neues Testverfahren basierend auf Chromosomen-KonformationsErfassung (chromosome conformation capturing; 3C) etabliert, um mit seiner Hilfe Interaktionen zwischen einem Telomer und seiner subtelomeren Region, als Maß für Telomer-Rückfaltung in Hefe, direkt zu detektieren und zu quantifizieren. Auf diese Art und Weise konnten wir die genetischen Vorteile des Hefe-Systems nutzen, um die mechanistischen Details der Telomerschleifenbildung und –erhaltung zu verstehen. Da eine Telomerverkürzung ein ungeschütztes Telomer zur Folge hat, stellten wir die Frage, ob die Telomerlänge Einfluss auf die Telomer-Rückfaltung haben könnte. Wir konnten einen erheblichen Rückfaltungsdefekt in Zellen mit fehlender Telomerase und in weiteren Mutanten mit kurzen Telomeren feststellen. Im Gegensatz dazu waren verlängerte Telomere weiterhin in der Lage Schleifen zu bilden. Dies suggeriert, dass eine kritische Telomerlänge essentiell für die Erhaltung der Telomerschleife ist und das Telomere in seneszenten Zellen wahrscheinlich in einer geöffneten Konformation vorliegen, was sie zugänglich für nukleolytischen Verdau und irreguläre DNA Reparaturvorgänge macht. Genschleifen (gene loops) sind eine weitere Art von rückgefaltetem Chromatin, die Promotoren und Terminatoren zusammen bringen. Genschleifen hängen sowohl von Transkription und einem funktionellen Transkriptions-Initiations-Komplex als auch von einigen Komponenten der mRNA Prozessierungsmaschine ab. Tatsächlich konnten wir eine defekte Bildung von Telomerschleifen nach Wegfall der RNA Polymerase II und in einem Mutanten des Transkriptions-InitiationsKomplex feststellen. Es konnte gezeigt werden, das bestimmte Chromatinschleifen, die Promotoren und Transkriptionsverstärker in nahe räumliche Nähe bringen, von einer nichtkodierenden RNA Art abhängen, die mit Komponenten des Promotor-assoziierten Mediator Komplex interagieren. Der nukleolytische Abbau von RNA oder eine Mutation des Mediator Komplexes führte zu reduzierter Telomerschleifenbildung, was eine ähnliche Regulation an Telomeren andeutet.