German Title: Die Rolle stromaler Wnt/Beta-catenin und epidermaler Ras-Raf-MEK-ERK MAPK Signalwegaktivität in humanen Plattenepithelkarzinomen

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Abstract

The prevalence of cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) is constantly increasing worldwide, however, the mechanisms driving tumorigenesis are not yet understood. The aim of this study was to understand the contribution of the Wnt/Beta-catenin and the Ras-Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways in cSCC development and progression using 2D keratinocyte monolayer cultures, 3D organotypic cultures of the skin (OTCs) as well as primary human cSCC samples.

Deregulated canonical Wnt signaling in tumor cells, as detected by nuclear translocation of Beta- catenin, is well described for a number of human cSCCs. Here, we found that aberrant Wnt/Beta- catenin activation is not restricted to tumor cells, but was additionally or exclusively detected in stromal fibroblasts. This suggested a second role of aberrant Wnt signaling in the stroma of developing cSCCs. Gene expression analysis of fibroblasts identified Interleukin-8 (IL-8), C-C motif chemokine 2 (CCL-2) and Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) as targets of Wnt/Beta-catenin. In agreement, IL-8 and CCL-2 were secreted by Wnt-3a-stimulated fibroblasts in OTCs and could also be detected in human cSCCs in situ. As consequence, IL-8 and CCL-2 caused hyper-proliferation and early invasion of non-tumorigenic HaCaT keratinocytes. Importantly, neutralizing antibodies against IL-8 and CCL-2 abolished these Wnt- dependent effects in OTCs. MMP-1 was also highly expressed in Wnt-3a-stimulated OTCs as well as in human cSCCs and was shown to be active. Furthermore, degradation of the basement membrane correlated with invasive growth of benign-tumorigenic H-Ras G12V -transfected HaCaT-RAS A-5 cells, demonstrating the importance of the Wnt-dependent fibroblast-keratinocyte cross-talk for skin cancer progression.

Ras-Raf-MEK-ERK MAPK signaling is constitutively active in most melanomas due to a B-Raf V600E - mutation leading to increased proliferation and survival. Clinical trials targeting oncogenic B-Raf in melanoma by mutation-specific inhibitors like Vemurafenib displayed high response rates, but caused at the same time development of cSCCs. This suggested a direct involvement of Vemurafenib in the progression of pre-existing lesions. Vemurafenib stimulation of B-Raf V600E -mutant A375 melanoma cells confirmed a block in MEK-ERK signaling, while all B-Raf wild-type cells, such as dermal fibroblasts and different keratinocytes, revealed MEK-ERK hyper-activation. Despite MAPK-activation, neither proliferation nor survival was altered in the keratinocytes. Analyses of continuously Vemurafenib treated HaCaT cells did not show genomic instability, but rather led to a selective growth advantage of genetic subpopulations. To study the role of aberrant B-Raf signaling in the tissue context, OTCs were treated with Vemurafenib. As result, Vemurafenib directly increased differentiation of the normal and transformed keratinocytes, resembling the hyperkeratotic skin phenotype of many melanoma patients. Remarkably, Vemurafenib stimulation of HaCaT-RAS A-5 cells caused high MMP-1 and MMP-3 expression, which correlated with Collagen remodeling and invasion into the stroma. Since both, differentiation and invasion were abolished by co-treatment with the MEK-inhibitor Cobimetinib and as patients receiving the same therapy showed highly decreased cSCC numbers, this strongly suggests that the phenotypes in in vitro as well as the rapidly developing well-differentiated cSCCs in vivo are direct results of Vemurafenib-induced ERK-activation.

Taken together, this work unraveled two novel aspects, namely Wnt/Beta-catenin deregulation in the tumor-stroma and aberrant Raf-MEK-ERK MAPK signaling in keratinocytes as oncogenic events driving cSCC progression.

Translation of abstract (German)

Weltweit steigt die Prävalenz kutaner Plattenepithelkarzinome (cSCCs), während die an der Tumorentstehung beteiligten Mechanismen noch nicht vollständig verstanden sind. Das Ziel dieser Studie war es, den Einfluss der Wnt/Beta-catenin und Ras-Raf-MEK-ERK MAPK-Signalwege an cSCC Entstehung und Wachstum mit Hilfe von 2D kultivierten Keratinozyten, 3D organotypischen Kulturen der Haut (OTCs) sowie primären humanen cSCC-Biopsien zu untersuchen.

Eine Deregulierung des Wnt Signalwegs, welche durch eine nukleäre Translokation von Beta-catenin detektiert werden kann, wurde bereits für cSCC Tumorzellen beschrieben. Wir konnten nicht nur eine abnormale Wnt/Beta-catenin-Aktivierung im Tumor, sondern auch oder ausschließlich in Fibroblasten des Stromas nachweisen, was eine zusätzliche Rolle eines deregulierten Wnt-Signalwegs impliziert. In Fibroblasten identifizierte eine Genexpressionsanalyse Interleukin-8 (IL-8), C-C motif chemokine 2 (CCL-2) und Matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) als Wnt/Beta-catenin induzierte Gene. Darüber hinaus wurden IL-8 und CCL-2 durch Wnt-3a-stimulierte Fibroblasten in OTCs sezerniert und konnten ebenso in humanen cSCCs nachgewiesen werden. Funktionell führte IL-8 und CCL-2 Stimulation von nicht-tumorigenen HaCaT-Zellen zu Hyperproliferation und ersten Invasionsmerkmalen. Die zusätzliche Behandlung von OTCs mit neutralisierenden Antikörpern gegen IL-8 und CCL-2 verhinderte diese Wnt- abhängigen Effekte. MMP-1 wurde ebenfalls in Wnt-3a-stimulierten OTCs sowie in humanen cSCCs exprimiert und aktiviert. Ein Basalmembran-Abbau begünstigte invasives Wachstum von gutartig- tumorigenen H-Ras G12V transfizierten HaCaT-RAS A-5-Zellen, was zusätzlich die Bedeutung einer Wnt- abhängige Interaktion zwischen Fibroblasten und Keratinozyten in der Karzinogenese aufzeigte.

Der Ras-Raf-MEK-ERK MAPK Signalweg ist in den meisten Melanomen aufgrund einer B-Raf V600E - Mutation konstitutiv aktiv und führt zu erhöhtem Wachstum und Überleben der Tumorzellen. Klinische Studien von Melanom-Patienten, die mit B-Raf V600E -Inhibitoren, wie Vemurafenib, behandelt wurden, zeigen eine deutliche Wachstumsreduktion dieser Tumore. Andererseits führte diese Therapie zu einer stark beschleunigten Entwicklung von cSCCs und legte daher eine direkte Beteiligung von Vemurafenib in der Progression bestehender Läsionen nahe. Vemurafenib-Stimulation von B-Raf V600E A375 Melanomzellen bestätigte einen Block des MEK-ERK-Signalwegs, führte allerdings in Fibroblasten und verschiedenen Keratinozyten zu einer MEK-ERK Hyperaktivierung. Trotz der stark erhöhten MAPK-Aktivität, waren weder Proliferation noch das Überleben der Keratinozyten verändert. Bei kontinuierlicher Vemurafenib- Behandlung von HaCaT-Zellen kam es zu einem selektiven Wachstumsvorteil von Sub-Populationen. Um die Rolle einer abnormalen B-Raf-Aktivierung im Gewebe zu untersuchen, wurden OTCs kontinuierlich mit Vemurafenib behandelt. Zum einen erhöhte Vemurafenib direkt die Differenzierung von normalen und transformierten Keratinozyten, was auch als hyperkeratotische Haut in vielen Melanom-Patienten beobachtet wurde. Zum anderen verursachte Vemurafenib in HaCaT-RAS A-5- Zellen eine hohe MMP-1 und MMP-3-Expression, die mit Collagen-Umbau und Invasion verbunden war. Da sowohl Differenzierung, als auch Invasion durch eine zusätzliche Behandlung mit dem MEK- Inhibitor Cobimetinib verhindert wurden und dies auch bei Melanom-Patienten zu einer verminderten cSCC-Anzahl führte, zeigte, dass die Phänotypen in vitro sowie die sich rasch entwickelnden und gut differenzierten cSCCs in vivo eine Folge der Vemurafenib-induzierten ERK-Aktivierung darstellen.

Diese Arbeit beschreibt Wnt/Beta-catenin Deregulierung im Stroma sowie eine abnomale Raf-MEK- ERK MAPK Aktivität in Keratinozyten als unabhängige Aspekte die zur cSCC-Progression beitragen.