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PDF, English - main document Download (17MB) | Lizenz: Genome-wide approaches for identifying genes involved in the maintenance of genomic stability by Segura Wang, Maia underlies the terms of Creative Commons Attribution 3.0 Germany

Abstract

The maintenance of genomic stability and the repair of DNA damage are essential for the survival of all cells. Despite diverse pathways for repair of DNA lesions, different mutations can arise, ranging from Single Nucleotide Variants (SNVs) to larger Structu- ral Variants (SVs). The processes that play a role in the formation of these alterations are not fully understood. In this thesis, I present two complementary approaches for accumulating genomic variants and for identifying pathways involved in the suppression of mutation formation using Saccharomyces cerevisiae (budding yeast) gene knockout strains. First, using next-generation sequencing, I studied neutral variants through a mutation accumulation assay for up to 1800 generations. I used 47 yeast strains with known defects in DNA replication, repair and recombination pathways. In all strains, small insertions and deletions (indels) were more common than larger SVs (>50bp). Most mutations occurred in repetitive sequences, implicating replication based mechanisms and homologous recombination in the formation of genomic variants. Furthermore, the knockout of MSH2 produced a hypermutable strain that acquired the highest number of indels. Moreover, the knockout of the genes SWR1 and ISW1, involved in chromatin remodeling, resulted in strains with high number of deletions. These results suggest that defects in establishing a correct chromatin architecture may play a role in the formation of genomic variants. I further performed a genome-wide screen for genes that suppress deletion formation under different drug treatments in the presence or absence of homologous repeats by using designed constructs. As expected, deletions occurred more often between repeats, in support of the frequent involvement of homologous recombination in the formation of chromosome rearrangements. In addition, I identified genes whose knockout led to incre- ased levels of deletions. Among these, IOC4 is of particular interest given that it belongs to the same chromatin remodeling complex as ISW1, identified in the neutral mutati- on accumulation assay. This provides further evidence that chromatin remodeling may be involved in preventing the occurrence of SVs. Furthermore, several meiosis-related mutants also showed increased levels of deletions, suggesting that meiosis proteins may have additional roles in the maintenance of genomic stability during vegetative growth. By performing additional experimental validations, I verified the higher vulnerability of meiosis gene knockouts to acquire deletions, especially in their diploid stages. In the last chapter, I briefly describe the results of several side projects in which I applied computational methods learned through the above mentioned projects, to identify and characterize genomic rearrangements in different human cancers. In summary, I have found that genome-wide approaches can provide interesting insights into the understanding of genomic variants in yeast and human cancers. In particular, given the evolutionary conservation of the ISWI chromatin remodeling complex and meiosis-related genes, the results presented here point to potentially novel functions of these proteins in the maintenance of genomic stability.

Translation of abstract (German)

Die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität sowie die Reparatur von DNA Schä- den sind essentiell für das Überleben aller Zellen. Trotz unterschiedlicher Mechanismen für die Behebung von DNA Defekten, können verschiedene Arten von Mutationen, wie zum Beispiel Einzelnukleotid-Variationen (SNVs) oder Strukturvariationen (SVs), auftreten. Die Prozesse, die bei deren Entstehung eine Rolle spielen sind noch nicht komplett verstanden. In dieser Arbeit stelle ich zwei komplementäre Ansätze zur An- reicherung von genomischen Veränderungen sowie zur Identifikation von, für die Ver- meidung von Mutationen wichtigen, Signalwegen vor. Für beide Ansätze verwendete ich Saccharomyces cerevisiae (Hefe) Gen-Knockout-Stämme. Als erstes untersuchte ich, unter Verwendung von Hochdurchsatz-Sequenzierung, neu- trale Mutationen anhand eines Mutations-Akkumulations-Experimentes über einen Zeit- raum von bis zu 1800 Generationen. Dabei verwendete ich 47 Hefestämme, welche be- kannte Defekte in DNA Replikations-, Reparatur-, und Rekombinationsmechanismen haben. In allen Stämmen waren Indels (kleine Insertionen und Deletionen) häufiger als große SVs (>50bp). Die meisten Mutationen traten in repetitiven Sequenzen auf, was auf eine Beteiligung replikations-basierender Mechanismen sowie homologer Rekom- bination bei der Entstehung genomischer Veränderungen deutet. Des Weiteren hatte der Knockout von MSH2 einen hypermutablen Stamm zur Folge, welcher die meis- ten Indels akkumulierte. Außerdem zeigten die Knockouts von SWR1 und ISW1 eine große Anzahl von Deletionen. Beide Gene sind an Chromatin-Umstrukturierungen be- teiligt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Probleme beim Aufbau einer korrekten Chromatin-Architektur eine wichtige Rolle bei der Entstehung genomischer Verände- rungen spielen könnten. Als zweiten Ansatz habe ich ein genomweites Screening mit Hilfe eines speziell entworfe- nen DNA Konstruktes durchgeführt, um Gene zu identifizieren, welche die Entstehung von Deletionen unterdrücken. Hierfür wurden verschiedene Bedingungen, wie die An- wendung unterschiedlicher Wirkstoffe sowie die An- beziehungsweise Abwesenheit ho- mologer Sequenzwiederholungen, getestet. Wie erwartet entstanden Deletionen häufiger zwischen Sequenzwiederholungen, welches die häufige Beteiligung homologer Rekom- bination bei dem Auftreten chromosomaler Veränderungen unterstreicht. Außerdem habe ich Gene identifiziert, deren Knockout zu einem erhöhten Level von Deletionen führte. Von diesen ist besonders IOC4 interessant, da es zum gleichen Chromatin- Umstrukturierungs-Komplex wie ISW1 gehört, welches im Mutations-Akkumulations- Experiment identifiziert wurde. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass die Chromatin- Umstrukturierung eine Rolle bei der Vermeidung von SVs spielen könnte. Des Weiteren zeigten Knockouts von in der Meiose beteiligte Genen ein verstärktes Auftreten von De- letionen, was darauf hindeutet, dass diese neben der Meiose auch bei der Erhaltung der genomischen Stabilität während des vegetativen Wachstums eine Rolle spielen könn- ten. Durch weitere experimentelle Validierungen konnte ich die erhöhte Anfälligkeit für Deletionen bei Meiose-Gen-Knockout-Stämmen bestätigen, vor allem in ihrer diploiden Form. Im letzten Kapitel dieser Arbeit gehe ich schließlich kurz auf mehrere Nebenprojekte ein, in denen ich bioinformatische Methoden, welche ich in den oben genannten Pro- jekten gelernt hatte, angewandt habe, um genomische Veränderungen in verschiedenen Krebsarten von Menschen zu identifizieren und zu charakterisieren. Zusammenfassend konnte ich zeigen, dass genomweite Ansätze interessante Einblicke in das Verständnis genomischer Veränderungen in Hefe und bei Krebserkrankungen geben können. Insbesondere in Anbetracht der evolutionären Konservierung des ISWI Chromatin-Umstrukturierungs-Komplexes und der in Meiose involvierten Gene weisen die hier präsentierten Ergebnisse auf mögliche neue Funktionen dieser Proteine beim Erhalt genomischer Stabilität hin.