English Title: Double-strand Break Induction and DNA Damage Response after 12C Ion and Photon Radiation in U87 Glioblastoma Cells

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Abstract

Schwerionenstrahlung entfaltet bei gleicher physikalischer Dosis eine höhere biologische Wirksamkeit als Photonenstrahlung. In dieser Arbeit wurden die Ursachen dafür anhand der DNA-Schadensantwort in U87 Glioblastomzellen untersucht. Ausschlaggebend sind hierbei DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), deren Induktion und Reparatur durch Messung des DSB-Markers γH2AX (phosphoryliertes Histon H2AX) im Kontext des Zellzyklus verfolgt wurde. Weiter wurde untersucht, ob es strahlenspezifische Unterschiede in der Wahl des DSB-Reparaturmechanismus gibt, und welche Folgen beim Scheitern der Reparatur eintreten. Die Untersuchungen ergaben, dass 12C-Ionen-Strahlung schwerer zu reparierende DSBs erzeugt als Photonenstrahlung, die etwas verzögert und langsamer repariert werden. Dies bewirkte stärker ausgeprägte und länger anhaltende Zellzyklusblockaden, vorwiegend am G2/M-Übergang, sowie eine höhere Apoptoserate bei 12C-Ionen-Strahlung. Autophagozytose als alternativer Weg des programmierten Zelltods spielte bei beiden Strahlenarten keine Rolle. Die Wirkung der 12C-Ionen hing weniger stark von der Zellzyklusphase ab als bei Photonenstrahlung. Dies zeigte sich besonders deutlich anhand der DSB-Reparaturgeschwindigkeit in der S- und G2-Phase. Die Zellen waren bei 12C-Ionen-Strahlung stärker auf die Reparatur durch homologe Rekombination (HRR) angewiesen als bei Photonenstrahlung, auch wenn in beiden Fällen vermutlich der Mechanismus der Nicht-homologen End-zu-End-Verknüpfung dominierte. Die Ursache dafür, dass 12C-Ionen- gegenüber Photonenstrahlung schwerer zu reparieren-de DSBs erzeugte, die langsamer und eher durch HRR repariert wurden, war höchstwahrscheinlich eine stärkere Clusterung der DSBs aufgrund der höheren Ionisationsdichte von 12C-Ionen-Strahlung. Die mikroskopische Untersuchung von immunfluoreszent markiertem γH2AX zeigte, dass die DSB-Reparaturfoci bei 12C-Ionen-Strahlung größer waren und mehr γH2AX -Moleküle enthielten (stärkere Fluoreszenz), obwohl ihre Anzahl vor Abschluss der Reparatur geringer war. Neben den Foci wurde auch ein schwächeres pan-nukleäres γH2AX -Signal beobachtet, das linear mit der Strahlendosis anstieg und bei 12C-Ionen-Strahlung stärker ausgeprägt war als bei Photonenstrahlung. Pan-nukleäres γH2AX als Folge von ionisierender Strahlung wird mit kleinen DNA-Fragmenten in Zusammenhang gebracht. Diese Indizien sprachen dafür, dass die Clusterung der DSBs, und nicht allein ihre Anzahl, aus-schlaggebend für die hohe relative biologische Wirksamkeit der 12C-Ionen-Strahlung ist. Weitere Hinweise auf geclusterte DSBs nach 12C-Ionen-Strahlung lieferten Untersuchungen der Reparaturfoci nach Immunfärbung von γH2AX und dem HRR-Enzym pBRCA1 mit Hilfe superauflösender Mikroskopie. Hierzu wurden die Zellen mit einzelnen bis einigen wenigen 12C-Ionen unter einem flachen Winkel bestrahlt. Durch Einsatz von strukturierter Beleuchtung (SIM) gelang es die Foci und ihren Kolokalisationsgrad im Verlauf der Reparatur mit einer hohen Genauigkeit jenseits der klassischen Auflösungsgrenze in 3D zu vermessen. Neben den primär entlang der Ionenflugbahn induzierten Foci traten nach 26h neue Sekundärfoci auf. Diese waren abweichend von der Ionenflugbahn verteilt und gingen vermutlich im Zuge der DNA-Replikation aus verbleibenden Nicht-DSB-Schäden hervor. In Übereinstimmung mit der Abhängigkeit solcher Sekundärfoci von der Reparatur durch Bruch-induzierte Replikation, einer Sonderform der HRR, wiesen die sekundären γH2AX Foci einen besonders hohen Kolokalisationsgrad mit pBRCA1 auf. Die innere Struktur der γH2AX Foci wurde mit SPDMPhymod, einer weiteren superauflösenden Mikroskopietechnik untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass die Foci, die Größen bis über 1,5 µm³ erreichen, nicht homogen aufgebaut sind, sondern über eine feine Substruktur verfügen. Demnach bestehen die Foci aus vielen Subfoci in der Größenordnung von 100nm mit teilweise länglicher Gestalt. Passend zur Organisation des Chromatins in dicht gepackten Schlaufen mit Interchromatin-Lücken ließen sich unterschiedliche Verläufe und Abstände zwischen den Subfoci erkennen.

Translation of abstract (English)

Heavy ion rdiation has greater biological effectiveness than the same physical dose of photon radiation. In this work the underlying reasons in the DNA damage response were analyzed in U87 glioblastoma cells. DNA double-strand breaks (DSBs) are the decicive lesions for the effectiveness of ionizing radiation. Their induction and repair was measured in the context of the cell cycle based on the DSB marker γH2AX (the phosphorylated form of the histone variant H2AX). Further, radiation-specific differences in choice of the DSB repair pathway was analyzed, as well as the consequences of repair failure. The results showed that in contrast to photons, 12C ion radiation produces more severe DSBs that are repaired delayed and with slower kinetics. Accordingly, stronger and longer lasting cell cycle delays, predominantly at the G2/M border, and a higher rate of apoptosis was detected for 12C ion radiation. Autophagy, an alternative mechanism of programmed cell death, was not relevant for neighter of the two types of radiation. The effect of 12C ion radiation was less dependent on the cell cycle stage than for photon radiation. This became particularly evident in the DSB repair velocities during S- and G2-phase. After 12C ion radiation, cells were more dependent on homologous recombination repair (HRR) compared to photon radiation. The reason therefore that in contrast to photons, 12C ion radiation induced graver DSBs that were repaired slower and more dependent on HRR, was most probably enhanced clustering of DSBs due to the higher ionization density of 12C ion radiation. Microscopic inspection of immunofluorently stained γH2AX revealed that 12C ion radiation induced bigger DSB repair foci containing more γH2AX molecules (higher fluorescence intensity), although their initial number was smaller. Besides the foci, a weaker pan-nuclear γH2AX staining was observed that increased in a dose-dependent manner and was more pronounced for 12C ion compared to photon radiation. Pan-nuclear γH2AX caused by ionizing radiation can be linked to the induction of small DNA fragments. These results indicated that the clustering of DSBs, rather than their sheer number, is decicive for the high relative biological effectiveness of 12C ion radiation. Further hints for clustered DSBs after 12C ion radiation were found by application of superresolution microscopy to analyze repair foci after immunofluorescent staining of γH2AX and the HRR enzyme pBRCA1. Therefore, cells were irradiated with individual or only few 12C ions under a flat angle. With the help of structured illumination microscopy (SIM), the foci and their colocalization could be measured with high accuracy beyond the classical resolution limit in 3D. Besides primary foci induced along the ion trajectory, new secondary foci appeared after 26h. They were scattered offside the ion track and were presumably caused by unrepaired non-DSB lesions in the course of DNA replication. In accordance with the dependency of such secondary DSBs on repair by break-induced replication, a HRR subpathway, colocalization between γH2AX and pBRCA1 was particularly high in the secondary foci. The inner structure of γH2AX foci was further analyzed with SPDMPhymod, another superresolution microscopy technique. This revealed that the foci, that can reach sizes up to more than 1,5 µm³, posess a fine substructure rather than being homogenous. The results indicated that the foci are composed of several subfoci in the range of 100 nm with partially elongated shape. In accordance with the organization of chromatin in densly packed loops with interchromatin spaces, different structures and distances between the subfoci could be observed.